脂聯(lián)素通過AdipoR1-APPL1信號通路保護缺血-再灌注心肌.pdf

1、研究背景及目的：
　　肥胖相關疾病對于缺血性心臟病的發(fā)生、嚴重程度和結果具有重要影響。有報道表明，在肥胖以及具有胰島素抵抗的狀態(tài)下脂聯(lián)素的血漿含量會降低從而導致額外的心血管疾病的風險增加。肥胖、高脂血癥和糖尿病（代謝綜合征）狀態(tài)下患者心梗風險增加,伴有血漿脂聯(lián)素水平下降，脂聯(lián)素與心梗發(fā)病率呈負相關。
　　脂聯(lián)素（APN）是體內的脂肪組織來源的激素，由白色和棕色脂肪組織合成分泌。脂聯(lián)素在血漿中的含量豐富并且發(fā)揮了多種保護作用。

2、大量研究顯示，脂聯(lián)素具有胰島素增敏，抗炎，抗動脈硬化的作用；此外，它在糖脂代謝方面也發(fā)揮了重要作用。大量研究證明，給予外源性脂聯(lián)素治療可通過激活 AMPK信號通路減輕正常心肌的缺血/再灌注損傷；此外，脂聯(lián)素亦可以通過降低氧化/硝化應激減輕缺血/再灌注損傷。脂聯(lián)素的這種心臟保護作用至少通過兩種分子機制：提高心肌細胞生存力以及降低TNF-α的產量。在心肌細胞中脂聯(lián)素可能是通過直接激活AMPK信號通路來發(fā)揮抗凋亡作用的。大量的體外實驗證明，A

3、MPK顯性失活會導致心肌細胞凋亡增加。與此同時，脂聯(lián)素減少心肌成纖維細胞的凋亡也通過AMPK信號通路。APN可以通過減輕氧化/硝化應激發(fā)揮心肌缺血/再灌注損傷的保護作用。大量實驗證明給予脂聯(lián)素治療不但可以顯著抑制內皮細胞釋放·O2-而且可消除被氧化了的低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）所誘導的·O2-產量的增加從而減輕心肌細胞的氧化應激。NO本身不具有毒性即使?jié)舛容^高時也不會引起一系列的組織損傷。但是

4、當 NO與局部過多的超氧化物發(fā)生反應時，可以生成極具細胞毒性的過氧硝酸鹽從而引起氧化/硝化應激，如NO與O2-反應生成具有毒性很強的ONOO-，ONOO-不僅通過破壞DNA損傷細胞,而且ONOO-還可以使蛋白質發(fā)生硝基化修飾,這種蛋白質的硝基化修飾可以在機體生理、病理信號通路中發(fā)揮關鍵的作用。有研究已證明給予脂聯(lián)素治療可以減輕這種損失作用。在正常生理情況下，脂聯(lián)素通過eNOS（endothelial Inducible nitric o

5、xide synthase）來增加NO的含量，并最終發(fā)揮血管/心臟的保護作用。但是相反的如果在病理條件下，iNOS（induced itric oxide synthase）的表達含量會增加，脂聯(lián)素則通過抑制iNOS的產量而降低NO的過度生成，從而減輕組織的硝化應激損傷。因此，明確脂聯(lián)素是否通過 AdipoR1-APPL1信號通路激活 AMPK發(fā)揮心臟保護作用。明確AdipoR1-APPL1信號通路是否在APN減輕心肌氧化/硝化應激中發(fā)

6、揮作用及其機制對于更好的將 APN的保護作用應用于臨床治療具有重要作用。
　　APPL1是一種具有多個功能結構域的信號蛋白，在APN的信號通路中擔當著重要角色。已知的脂聯(lián)素膜受體有兩種亞型AdipoR1和AdipoR2。AdioR1主要分布在骨骼肌而AdipoR2主要分布在肝臟。大量研究表明，在骨骼肌中APN主要通過APPL1來激活AMPK從而發(fā)揮保護作用。近期的大量實驗結果顯示，APPL1-AMPK信號軸介導了脂聯(lián)素在心臟的有益

7、代謝作用。在心肌中，脂聯(lián)素可以通過AdipoR1-APPL1信號通路激活下游信號分子調節(jié)心肌的糖脂代謝。當發(fā)生心肌缺血/再灌注損傷時，APPL1的保護作用尚未見報道，其間可能涉及的APPL1依賴的信號通路也不清楚。明確 AdipoR1-APPL1信號通路是否介導了脂聯(lián)素減輕心肌缺血/再灌注損傷的作用及其機制將為提供以脂聯(lián)素作為干預及治療靶點的治療心肌缺血/再灌注損傷的新方法。
　　因此，本研究擬通過細胞模型：1）是否 AdipoR

8、1-APPL1通過激活AMPK-對MI/R損傷發(fā)揮保護作用。2）是否AdipoR1-APPL1通過降低氧化/硝化應激來減輕MI/R損傷。
　　實驗方法：
　　實驗一：誘導SD乳鼠心肌細胞缺氧/復氧模擬心肌缺血/再灌：分離培養(yǎng)原代乳鼠心肌細胞，待細胞分離培養(yǎng)后3～4天更換培養(yǎng)液為缺血液，隨后把心肌細胞放入37℃缺氧孵箱內孵育12 h，更換正常培養(yǎng)液，然后再放入37℃5％CO2孵箱內孵育6h后采用原位末端轉移酶標記技術（TUNE

9、L）、Caspase-3活性檢測心肌細胞凋亡率，心肌細胞明顯凋亡。說明成功通過細胞缺氧/復氧建立了心肌缺血/再灌模型。
　　實驗二：下調心肌細胞中APPL1的表達觀察脂聯(lián)素對心肌缺血/再灌的影響極其作用機制：根據GeneBank提供的SD大鼠APPL1序列，由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成siRNA。并用siRNA轉染心肌細胞，通過Western Blot蛋白定量方法檢測APPL1的表達被抑制。然后誘導心肌細胞缺氧/復氧模擬心肌

10、缺血/再灌，一部分細胞采用原位末端轉移酶標記技術（TUNEL）、caspase-3活性檢測心肌細胞凋亡率；另外收集細胞樣品并提取細胞蛋白，通過Western Blot檢測AMPK，eNOS，iNOS的表達。
　　實驗結果：
　　1、分離培養(yǎng)原代乳鼠心肌細胞并誘導其缺氧/復氧模擬MI/R
　　培養(yǎng)4～6 h的乳鼠心肌細胞開始貼壁生長，12～24 h明顯增殖，3～4 d后細胞融合成片；心肌細胞由圓形變?yōu)樗笮巍⑿切?、多角形?/p>

11、并出現自發(fā)性節(jié)律性搏動。
　　2、脂聯(lián)素可抑制H/R誘導的心肌細胞凋亡
　　采用原位末端轉移酶標記技術（TUNEL）檢測心肌細胞凋亡率。與對照組相比，H/R組的心肌細胞 AI明顯增加[n=6，P<0.01]。與 H/R相比，H/R+APN組心肌細胞AI明顯降低[n=6，P<0.01]，差異有統(tǒng)計學意義；Caspase-3活性增加（P<0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。
　　3、APN通過AdipoR1-APPL1減輕MI

12、/R損傷及可能機制
　　1）下調心肌細胞中的APPL1加重了MI/R損傷；
　　與對照組相比，H/R組 APPL1表達顯著減少[n=3，P<0.05]；和H/R相比，H/R+gAd組的APPL1表達明顯增加[n=3，P<0.05]；采用RNAi法抑制心肌細胞的APPL1表達后。與未轉染組相比，β-actin轉染后各處理組心肌細胞AI無明顯變化（n=6，P>0.05）；與β-actin組相比， APPL1 RNAi各處理組心肌

13、細胞AI明顯增加（P<0.01），且gAd處理不能有效降低AI，提示APPL1被干涉后可阻斷脂聯(lián)素的抗凋亡作用從而增加MI/R損傷。
　　2）APN可能通過激活AdipoR1-APPL1-AMPK減少MI/R損傷；
　　與Control組相比，H/R組心肌細胞凋亡增加，p-AMPK增加（P<0.05），與 H/R組相比，H/R+gAd組心肌細胞凋亡降低（P<0.05），心肌組織caspase-3活性降低（P<0.05），p-

14、AMPK增加（P<0.05），差異均有統(tǒng)計學意義；與H/R+gAd組相比, H/R+APPL1siRNA+gAd組心肌細胞凋亡增加（P<0.05），心肌組織 Caspase-3活性增加（P<0.05），p-AMPK降低（P<0.05），差異均有統(tǒng)計學意義；下調APPL1表達 p-AMPK降低。
　　3）APN通過AdipoR1-APPL1信號通路減輕氧化/硝化應激來發(fā)揮MI/R損傷的保護作用；
　　與 H/R組相比,H/R+

15、gAd組心肌細胞凋亡減少（P<0.05），心肌組織Caspase-3活性減少（P<0.05），eNOS磷酸化增加（P<0.05），iNOS濃度減少（P<0.05），差異均有統(tǒng)計學意義；與H/R+gAd組相比，APPL1siRNA組eNOS磷酸化降低（P<0.05），iNOS濃度增加（P<0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　本研究首次證實脂聯(lián)素可以通過AdipoR1-APPL1信號通路減輕心肌缺血/再灌注傷，其下