人成熟脂肪細胞暴露于反油酸和油酸對脂聯素生成影響的評價.pdf

1、前言
　　脂肪是人體重要的三大供能物質之一，是由甘油和脂肪酸組成的三酰甘油酯。其中脂肪酸按其結構分為飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸。在不飽和脂肪酸分子中，因雙鍵位置的不同產生異構化分子，可分為順式脂肪酸和反式脂肪酸(transfattyacids，TFA)。TFA的主要來源有兩類，一類為天然來源，另外一類為工業(yè)來源。天然的TFA主要來自于反芻動物（如牛、羊）脂肪組織及其乳制品。工業(yè)來源的TFA主要產生于油脂的氫化、精煉、儲存和食品加工過

2、程中，其中油脂的部分氫化為食品中TFA的最主要來源之一，氫化油廣泛用于一系列食品中，主要為涂抹醬、烘焙食品及快餐中。其中油酸(oleicacid，OA)的反式異構體，即反油酸(elaidicacid，EA;trans-9-18∶1)為工業(yè)來源TFA的最主要異構體，約占30％，是TFA的主要代表物之一。近幾年隨著生活節(jié)奏加快、東西方交流的增加，國民飲食習慣不斷西化，氫化油脂的生產和應用不斷擴大，工業(yè)來源的反式脂肪酸已深入國人的生活，在膳食

3、中的比重逐漸升高。膳食中80％～90％的TFA來源于加工食品，有學者分析我國日常膳食原料，測定結果表明我國食物中普遍存在TFA。
　　工業(yè)來源的TFA很容易被人體吸收、代謝，沉積在脂肪、心、腎、肝、肌肉等多器官組織中。人日常攝入TFA所產生的有害作用，主要是由工業(yè)來源的TFA所引起。較高的TFA攝入可導致代謝紊亂:對脂質循環(huán)產生不利影響，引發(fā)系統性炎癥，加重胰島素抵抗，增加內臟脂肪和體重。另外兩項長期的人群前瞻性觀察研究中提示TF

4、A的攝入促進體重增加，特別是腹部脂肪的積累。而腹型肥胖與胰島素抵抗及腦血管疾病患病風險三者是緊密相聯系的。TFA的攝入在肥胖的發(fā)生發(fā)展中具有無法估量的影響，但人們對TFA與肥胖發(fā)生發(fā)展之間的具體機制了解較少。
　　肥胖人群體內脂肪大量蓄積，脂肪組織分泌的脂聯素(Adiponectin，APN)等各種脂肪細胞因子生成異常，被認為是慢性低炎性狀態(tài)、胰島素抵抗、糖尿病、心腦血管等疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因。如脂聯素在體內生理功能主要是增加胰

5、島素敏感性，促進糖脂代謝，改善胰島素抵抗，脂聯素還能通過抑制動脈粥樣硬化因子的產生和抑制血管內皮細胞炎癥及黏附等機制發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。因此研究TFA對脂聯素生成的影響有助于理解TFA與肥胖發(fā)生發(fā)展及其相關疾病之間的關系。
　　以往人們關于TFA對脂肪組織作用的研究，實驗動物結果往往受種屬差異的影響;而一些人群膳食調查及干預研究，大多集中在TFA對人血脂代謝和血糖代謝方面的影響，或是目前人們發(fā)現TFA攝入降低血漿中脂聯素水平

6、，而對人脂肪細胞脂聯素生成的影響作用了解甚少。本研究采用人脂肪細胞作為研究對象，將其直接暴露于TFA的典型代表物EA及其同分異構體OA。觀察OA和EA對人脂肪細胞脂聯素生成的影響，可消除種屬差異對結果的影響，同時也避免了人群調查及干預研究中的一些混雜因素的干擾作用。
　　本實驗將來源于人腹部皮下脂肪組織的前脂肪細胞(humanadiposetissue-derivedstromalcells，hADSCs)誘導分化為成熟脂肪細胞后

7、暴露于OA和EA中。同時并對其供體來源的均衡性做檢驗，觀察其對脂聯素的基因和蛋白表達水平的影響，并探討油酸和反式脂肪酸對脂肪細胞產生以上影響的可能作用機制，為TFA對脂肪細胞內分泌功能影響的機制研究提供參考。
　　實驗方法
　　采用體外細胞實驗。取剖腹產手術產婦的腹部皮下脂肪組織，分離hATSCs并傳代培養(yǎng)。并對細胞供體來源做均衡性檢驗。用MTT比色法檢測細胞增殖活力確定合適的OA、EA暴露濃度。誘導hATSCs向成熟脂肪細

8、胞分化，采用油紅O染色和蘇木精復染的方法從形態(tài)學上鑒定成熟脂肪細胞。Real-TimePCR方法檢測孕產婦脂肪組織對脂肪細胞因子脂聯素、瘦素、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactorα，TNF-α)的表達水平，以及檢測暴露于OA、EA后的成熟脂肪細胞的APN表達水平。采用酶聯免疫吸附試驗ELISA方法對其蛋白表達水平進行檢測。采用游離脂肪酸(freefattyacids，FFA)檢測試劑盒對細胞外FFA進行檢測。

9、　　實驗結果
　　1、供體組織來源均衡性檢驗——孕產婦妊娠期增重對孕婦自身脂肪細胞因子表達的影響
　　對照美國IOM制定的孕期增重推薦的標準，將供體妊娠期體重增長劃分為三組，即孕期體重增加不足組(L)、正常組(N)、過度組(E)。孕婦妊娠期脂肪組織APN、Lep和TNF-α基因mRNA表達水平的差異，結果顯示孕婦妊娠期體重增長程度不同，對孕婦自身脂肪細胞因子表達影響差異無統計學意義（P均＞0.05）。
　　2、hATS

10、Cs的原代培養(yǎng)及誘導hATSCs向成熟脂肪細胞分化（油紅O染色、蘇木精染色）
　　初分離的細胞接種4h后開始貼壁，約24h后細胞開始伸展，呈成纖維細胞樣梭形，生長有方向性。約5～9天后細胞可傳代，傳代后細胞仍呈成纖維細胞樣生長。
　　將持續(xù)誘導分化9～12天左右的hATSCs油紅O染色和蘇木精染色。經油紅O染色后可見，匯合的細胞因收縮而形成網狀結構，胞質內有大量油紅O染色顆粒存在。蘇木精復染，細胞核呈深藍色。
　　3、

11、OA暴露對hATSCs增殖/毒性的影響
　　暴露于OA培養(yǎng)24h、48h、72h后，當OA濃度范圍在0～25μmol/L時，對hATSCs增殖的影響差異無統計學意義（P均＞0.05）;當OA的濃度≥50μmol/L時，對hATSCs的增殖有抑制作用（P均＜0.05）。
　　4、EA暴露對hATSCs增殖/毒性的影響
　　暴露于EA培養(yǎng)24h、48h、72h后，當EA濃度范圍在0～25μmol/L時，對hATSCs增殖的

12、影響差異無統計學意義（P均＞0.05）;當EA的濃度≥50μmol/L時，對hATSCs的增殖有抑制作用（P均＜0.05）。
　　5、OA和EA對APNmRNA表達及蛋白生成水平的影響
　　與對照組(0μmol/L)比較，5、25μmol/LOA暴露組人成熟脂肪細胞APNmRNA的表達水平均較低，EA各劑量暴露組(1、5、25μmol/L)人成熟脂肪細胞APNmRNA的表達水平均較高，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。與

13、對照組（0μmol/L）比較，OA與EA各劑量暴露組（1、5、25μmol/L）人成熟脂肪細胞APN蛋白生成水平均較低，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。
　　6、EA和OA暴露對人脂肪細胞脂肪生成的影響
　　EA和OA各劑量暴露組(1、5、25μmol/L)與對照組相比較，OA與EA暴露組相比較，培養(yǎng)液上清中游離脂肪酸含量差異均無統計學意義（P均＞0.05）。
　　結論
　　1.將人成熟脂肪細胞暴露于油酸9