人成熟脂肪細(xì)胞暴露于反油酸和油酸對脂聯(lián)素生成影響的評價(jià).pdf

1、前言
　　脂肪是人體重要的三大供能物質(zhì)之一，是由甘油和脂肪酸組成的三酰甘油酯。其中脂肪酸按其結(jié)構(gòu)分為飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸。在不飽和脂肪酸分子中，因雙鍵位置的不同產(chǎn)生異構(gòu)化分子，可分為順式脂肪酸和反式脂肪酸(transfattyacids，TFA)。TFA的主要來源有兩類，一類為天然來源，另外一類為工業(yè)來源。天然的TFA主要來自于反芻動(dòng)物（如牛、羊）脂肪組織及其乳制品。工業(yè)來源的TFA主要產(chǎn)生于油脂的氫化、精煉、儲存和食品加工過

2、程中，其中油脂的部分氫化為食品中TFA的最主要來源之一，氫化油廣泛用于一系列食品中，主要為涂抹醬、烘焙食品及快餐中。其中油酸(oleicacid，OA)的反式異構(gòu)體，即反油酸(elaidicacid，EA;trans-9-18∶1)為工業(yè)來源TFA的最主要異構(gòu)體，約占30％，是TFA的主要代表物之一。近幾年隨著生活節(jié)奏加快、東西方交流的增加，國民飲食習(xí)慣不斷西化，氫化油脂的生產(chǎn)和應(yīng)用不斷擴(kuò)大，工業(yè)來源的反式脂肪酸已深入國人的生活，在膳食

3、中的比重逐漸升高。膳食中80％～90％的TFA來源于加工食品，有學(xué)者分析我國日常膳食原料，測定結(jié)果表明我國食物中普遍存在TFA。
　　工業(yè)來源的TFA很容易被人體吸收、代謝，沉積在脂肪、心、腎、肝、肌肉等多器官組織中。人日常攝入TFA所產(chǎn)生的有害作用，主要是由工業(yè)來源的TFA所引起。較高的TFA攝入可導(dǎo)致代謝紊亂:對脂質(zhì)循環(huán)產(chǎn)生不利影響，引發(fā)系統(tǒng)性炎癥，加重胰島素抵抗，增加內(nèi)臟脂肪和體重。另外兩項(xiàng)長期的人群前瞻性觀察研究中提示TF

4、A的攝入促進(jìn)體重增加，特別是腹部脂肪的積累。而腹型肥胖與胰島素抵抗及腦血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)三者是緊密相聯(lián)系的。TFA的攝入在肥胖的發(fā)生發(fā)展中具有無法估量的影響，但人們對TFA與肥胖發(fā)生發(fā)展之間的具體機(jī)制了解較少。
　　肥胖人群體內(nèi)脂肪大量蓄積，脂肪組織分泌的脂聯(lián)素(Adiponectin，APN)等各種脂肪細(xì)胞因子生成異常，被認(rèn)為是慢性低炎性狀態(tài)、胰島素抵抗、糖尿病、心腦血管等疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因。如脂聯(lián)素在體內(nèi)生理功能主要是增加胰

5、島素敏感性，促進(jìn)糖脂代謝，改善胰島素抵抗，脂聯(lián)素還能通過抑制動(dòng)脈粥樣硬化因子的產(chǎn)生和抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥及黏附等機(jī)制發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。因此研究TFA對脂聯(lián)素生成的影響有助于理解TFA與肥胖發(fā)生發(fā)展及其相關(guān)疾病之間的關(guān)系。
　　以往人們關(guān)于TFA對脂肪組織作用的研究，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)果往往受種屬差異的影響;而一些人群膳食調(diào)查及干預(yù)研究，大多集中在TFA對人血脂代謝和血糖代謝方面的影響，或是目前人們發(fā)現(xiàn)TFA攝入降低血漿中脂聯(lián)素水平

6、，而對人脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素生成的影響作用了解甚少。本研究采用人脂肪細(xì)胞作為研究對象，將其直接暴露于TFA的典型代表物EA及其同分異構(gòu)體OA。觀察OA和EA對人脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素生成的影響，可消除種屬差異對結(jié)果的影響，同時(shí)也避免了人群調(diào)查及干預(yù)研究中的一些混雜因素的干擾作用。
　　本實(shí)驗(yàn)將來源于人腹部皮下脂肪組織的前脂肪細(xì)胞(humanadiposetissue-derivedstromalcells，hADSCs)誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后

7、暴露于OA和EA中。同時(shí)并對其供體來源的均衡性做檢驗(yàn)，觀察其對脂聯(lián)素的基因和蛋白表達(dá)水平的影響，并探討油酸和反式脂肪酸對脂肪細(xì)胞產(chǎn)生以上影響的可能作用機(jī)制，為TFA對脂肪細(xì)胞內(nèi)分泌功能影響的機(jī)制研究提供參考。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。取剖腹產(chǎn)手術(shù)產(chǎn)婦的腹部皮下脂肪組織，分離hATSCs并傳代培養(yǎng)。并對細(xì)胞供體來源做均衡性檢驗(yàn)。用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖活力確定合適的OA、EA暴露濃度。誘導(dǎo)hATSCs向成熟脂肪細(xì)

8、胞分化，采用油紅O染色和蘇木精復(fù)染的方法從形態(tài)學(xué)上鑒定成熟脂肪細(xì)胞。Real-TimePCR方法檢測孕產(chǎn)婦脂肪組織對脂肪細(xì)胞因子脂聯(lián)素、瘦素、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactorα，TNF-α)的表達(dá)水平，以及檢測暴露于OA、EA后的成熟脂肪細(xì)胞的APN表達(dá)水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA方法對其蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。采用游離脂肪酸(freefattyacids，F(xiàn)FA)檢測試劑盒對細(xì)胞外FFA進(jìn)行檢測。

9、　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、供體組織來源均衡性檢驗(yàn)——孕產(chǎn)婦妊娠期增重對孕婦自身脂肪細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　對照美國IOM制定的孕期增重推薦的標(biāo)準(zhǔn)，將供體妊娠期體重增長劃分為三組，即孕期體重增加不足組(L)、正常組(N)、過度組(E)。孕婦妊娠期脂肪組織APN、Lep和TNF-α基因mRNA表達(dá)水平的差異，結(jié)果顯示孕婦妊娠期體重增長程度不同，對孕婦自身脂肪細(xì)胞因子表達(dá)影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。
　　2、hATS

10、Cs的原代培養(yǎng)及誘導(dǎo)hATSCs向成熟脂肪細(xì)胞分化（油紅O染色、蘇木精染色）
　　初分離的細(xì)胞接種4h后開始貼壁，約24h后細(xì)胞開始伸展，呈成纖維細(xì)胞樣梭形，生長有方向性。約5～9天后細(xì)胞可傳代，傳代后細(xì)胞仍呈成纖維細(xì)胞樣生長。
　　將持續(xù)誘導(dǎo)分化9～12天左右的hATSCs油紅O染色和蘇木精染色。經(jīng)油紅O染色后可見，匯合的細(xì)胞因收縮而形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)內(nèi)有大量油紅O染色顆粒存在。蘇木精復(fù)染，細(xì)胞核呈深藍(lán)色。
　　3、

11、OA暴露對hATSCs增殖/毒性的影響
　　暴露于OA培養(yǎng)24h、48h、72h后，當(dāng)OA濃度范圍在0～25μmol/L時(shí)，對hATSCs增殖的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）;當(dāng)OA的濃度≥50μmol/L時(shí)，對hATSCs的增殖有抑制作用（P均＜0.05）。
　　4、EA暴露對hATSCs增殖/毒性的影響
　　暴露于EA培養(yǎng)24h、48h、72h后，當(dāng)EA濃度范圍在0～25μmol/L時(shí)，對hATSCs增殖的

12、影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）;當(dāng)EA的濃度≥50μmol/L時(shí)，對hATSCs的增殖有抑制作用（P均＜0.05）。
　　5、OA和EA對APNmRNA表達(dá)及蛋白生成水平的影響
　　與對照組(0μmol/L)比較，5、25μmol/LOA暴露組人成熟脂肪細(xì)胞APNmRNA的表達(dá)水平均較低，EA各劑量暴露組(1、5、25μmol/L)人成熟脂肪細(xì)胞APNmRNA的表達(dá)水平均較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與

13、對照組（0μmol/L）比較，OA與EA各劑量暴露組（1、5、25μmol/L）人成熟脂肪細(xì)胞APN蛋白生成水平均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。
　　6、EA和OA暴露對人脂肪細(xì)胞脂肪生成的影響
　　EA和OA各劑量暴露組(1、5、25μmol/L)與對照組相比較，OA與EA暴露組相比較，培養(yǎng)液上清中游離脂肪酸含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。
　　結(jié)論
　　1.將人成熟脂肪細(xì)胞暴露于油酸9