RacA與Cdc42調(diào)節(jié)雙型真菌萊氏野村菌的極性生長和微菌核形成.pdf

1、蟲生真菌是一種環(huán)境友好型真菌,在防治農(nóng)林害蟲時有對環(huán)境無污染、無殘留和不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點。隨著人們環(huán)保意識的增強,人們對環(huán)境友好型農(nóng)藥的研究也在逐漸加強。萊氏野村菌是一種重要的昆蟲病原真菌,在田間能夠侵染多種夜蛾科害蟲并引起流行病。萊氏野村菌的有效成分為分生孢子,但是由于其產(chǎn)孢需要苛刻的營養(yǎng)和持續(xù)光照,限制了大規(guī)模生產(chǎn)。重慶大學生命科學學院微生物實驗室采用誘導發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)出了微菌核,并對其的抗逆性和毒力等進行研究,證實微菌核可以代替分

2、生孢子作為有效的活性成分。其后,采用比較轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究微菌核形成的分子機理,發(fā)現(xiàn)在微菌核形成過程中伴隨著菌絲的極性生長和氧脅迫(ROS)的產(chǎn)生。本論文是從比較轉(zhuǎn)錄組上調(diào)表達的cDNA文庫中挑取racA與cdc42基因,將其克隆并證明二者參與菌絲的極性生長和微菌核的形成。主要研究成果:
　?、倌繕嘶蚩寺¤b定:采用SMART RACE RT-PCR技術(shù)獲得racA與cdc42的cDNA和基因組序列,ORF分別為657bp和555bp

3、,各自編碼218和184個氨基酸;
　?、谀繕嘶虻纳镄畔W分析:采用生物信息學軟件對蛋白序列進行分析發(fā)現(xiàn),RacA與Cdc42蛋白都有Rho家族所特有的G1-G5 box和兩個分子開關(guān);利用MEGA4.0和ClustalX軟件構(gòu)建多個物種的系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)萊氏野村菌的RacA與Cdc42蛋白與蝗綠僵菌的親緣關(guān)系最近;
　?、畚⒕诵纬傻膭討B(tài)過程:顯微觀察萊氏野村菌微菌核液體發(fā)酵發(fā)育形成的動態(tài)過程,發(fā)現(xiàn)在其形成過程中伴隨著兩

4、態(tài)型(酵母狀細胞與菌絲型)菌體的轉(zhuǎn)變;微菌核是由極性菌絲纏繞而成;在微菌核成熟的后期,培養(yǎng)瓶里出現(xiàn)二輪菌絲的生長;
　　④目標基因表達模式分析:收集各個時期的樣品,采用qPCR的方法對racA、cdc42與NADPH復合體(noxA和noxR為其主要輔助因子)的表達模式進行分析,發(fā)現(xiàn) racA,cdc42與 NADPH復合體在微菌核形成初期表達量高,racA與 cdc42在兩態(tài)型菌體轉(zhuǎn)變的時期表達量也較高;
　　⑤racA與

5、cdc42的功能驗證:為了進一步研究racA與cdc42的功能,以egfp干擾菌株為陰性對照,采用體外RNAi的方法進行深入研究,發(fā)現(xiàn)相對于對照組,干擾菌株尤其是雙干擾菌株(racA&cdc42RM)生長緩慢,菌落變小;racA干擾菌株(racARM)與cdc42干擾菌株(cdc42RM)的兩態(tài)型轉(zhuǎn)變延遲2-3d;產(chǎn)孢時間延遲,產(chǎn)孢量減少;racARM的孢子變大,菌絲變粗且分枝增多,cdc42RM則與對照組無顯著性差異;單干擾菌株的微菌

6、核數(shù)量減少為對照組的3％-4％,菌液不粘稠;racARM的微菌核形態(tài)小于cdc42RM,但大于對照組;racA&cdc42RM的菌株生長遲緩,幾乎處于酵母狀細胞的菌落狀態(tài),幾乎沒有孢子(1‰)和微菌核(3‰)產(chǎn)生,且形態(tài)不均一;菌絲粗大且分枝增多;
　?、轗OS檢測:采用氮藍四唑(NBT)對各菌株產(chǎn)生的ROS的量進行分析,發(fā)現(xiàn)racARM和cdc42RM產(chǎn)生的ROS的量少于對照組,在racA&cdc42RM中,幾乎檢測不到ROS的

7、產(chǎn)生;
　?、吒蓴_后基因的表達模式分析:采用qPCR對各菌株的noxA與noxR的表達量進行分析發(fā)現(xiàn)干擾菌株中二者的表達量都下降;
　?、喽玖y定:采用點滴接種法(將菌株接種到三齡菜青蟲的角質(zhì)層上)對各菌株的毒力進行分析發(fā)現(xiàn)干擾菌株的致死率下降,LT50延長;
　　⑨各基因關(guān)系的初探:采用qPCR的方法對racA、cdc42、NOX復合體以及cdc24之間的關(guān)系進行初探,發(fā)現(xiàn)在racARM中,cdc42的表達量顯著上升

8、;在cdc42RM中,racA的表達量顯著下降;干擾菌株中noxA與noxR的表達量都下降,但cdc42RM中的下降程度大于racARM,雙干擾菌株中的表達量最少;racARM與cdc42RM中的cdc24的表達量都顯著上升。
　　結(jié)論:克隆得到萊氏野村菌的racA與cdc42,二者功能有部分重疊,比如影響菌絲的生長、產(chǎn)孢量、微菌核的形成、ROS的產(chǎn)生和毒力;但racA在菌絲的極性生長中發(fā)揮更重要的作用;racA與cdc42可能通