CD147-Sp1關系環(huán)對卵巢癌細胞侵襲性影響的研究.pdf

1、卵巢癌（ovarian cancer,OC）是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于宮頸癌與子宮內膜癌之后，排名第三[1-3]，其中上皮性腫瘤占原發(fā)性卵巢腫瘤的50％~70%，而惡性類型占卵巢癌的85%~90%[4]。多數(shù)卵巢癌病人由于早期缺乏明顯的臨床癥狀和高效的篩查技術,在發(fā)現(xiàn)時已為時已晚，并且期別也很高，也就促成了卵巢癌的治療難度大、復發(fā)率高，5年生存率非常低的嚴峻形勢[5]。
　　CD147，又名EMMPRIN或 Ba

2、sigin，是一個高度糖基化的跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員[6-9]。CD147通過誘導基質金屬蛋白酶（MMPs）分泌降解細胞外基質或通過上調 VEGF表達、抑制凋亡等多種途徑促進腫瘤侵襲轉移[10-12]。CD147的高表達與卵巢癌的不良預后息息相關[13]，作為一種重要的腫瘤標志物，闡明其表達調控機制對卵巢癌的診斷及治療具有重要意義。
　　孔等[14]的研究發(fā)現(xiàn)轉錄因子Sp1能直接與CD147啟動子區(qū)特異結合并能有效啟動

3、其轉錄表達。此外，他們還發(fā)現(xiàn)CD147的低甲基化可以增加其與Sp1蛋白的親和力，從而上調CD147表達。
　　研究報道提示Sp1蛋白的磷酸化形式對于Sp1介導的基因轉錄激活作用具有重要意義[15]。Sp1的磷酸化形式或可增加其與DNA的結合能力，或可增加其蛋白的穩(wěn)定性，或可影響它的轉錄活性。Tan等發(fā)現(xiàn)管緊張素Ⅱ激活PKC通路使Sp1的鋅指結構域（Thr668，Ser670和Thr681位點）磷酸化，磷酸化后的Sp1與血小板衍生因

4、子-D啟動子的結合能力增加[16]。阻斷JNK信號通路導致的Sp1在Thr278和Thr739位點的磷酸化，可以導致Sp1的蘇木素化，加速降解[17,18]。由于Sp1的轉錄活性受到其與啟動子的結合能力，蛋白的合成，核酸轉運能力，與其它蛋白的相互作用以及蛋白的穩(wěn)定性等多種因素影響，很難判斷Sp1的磷酸化對CD147轉錄活性的影響。
　　本課題的研究目標有四點：首先明確Sp1磷酸化是否參與CD147基因調控，其次探討其具體調控機制[

5、19]，再次分析Sp1磷酸化與CD147基因的相互作用對卵巢癌侵襲性的影響，最后分別在卵巢癌細胞及組織中分析Sp1磷酸化與CD147表達的相關性[20]。
　　第一部分：明確Sp1磷酸化參與CD147基因表達調控。我們運用基因定點突變的方法構建了6個Sp1磷酸化位點的突變體（Thr355，Thr453，Th668，Ser670，Thr681，Thr739）[21,22]，將特定位點的絲?蘇氨酸突變成谷氨酸，使其失去被磷酸化激活的功

6、能。之后通過瞬時轉染突變體和CD147啟動子檢測螢火蟲熒光素酶強度發(fā)現(xiàn)Sp1在Thr453和Thr739兩個位點的突變可以顯著降低Sp1對CD147基因表達上調的作用[23]。在隨后的實時定量PCR和Western blot的實驗中也得到了驗證。
　　第二部分：探討Sp1磷酸化調控CD147基因表達機制。為了探討Sp1磷酸化參與CD147基因表達調控的具體機制，我們運用PI3K/AKT和MAPK/ERK磷酸化通路特定抑制劑LY29

7、4002、雷帕霉素和PD98059預處理卵巢癌細胞后發(fā)現(xiàn)[24]，Sp1在Thr453和Thr739兩個位點的磷酸化水平會隨之下降，而總蛋白未見明顯變化。此外，我們還發(fā)現(xiàn) CD147的蛋白水平也隨之下降，提示通過 PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK途徑可以激活Sp1的磷酸化，而當Sp1磷酸化水平受抑制時，CD147的表達水平也下降，提示Sp1磷酸化對Sp1激活CD147基因轉錄具有激活作用。而當我們上調或下調CD147的表達后

8、，發(fā)現(xiàn)pAKT，p70S6k和pERK以及Sp1在Thr453和Thr739兩個位點的磷酸化水平均下降，而總蛋白均未見明顯變化。綜合第一部分實驗，我們得知Sp1在Thr453和Thr739位點的磷酸化可以增強Sp1對CD147基因的轉錄激活作用，而在SKOV3細胞中過表達CD147基因后，Sp1在Thr453和Thr739位點的磷酸化表達增加[25]。這是由于上游的PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK通路被活化造成的。CD147

9、-Sp1關系環(huán)構成的正反饋環(huán)路可能成為解釋CD147差異性表達的原因之一。
　　第三部分：檢測Sp1磷酸化與CD147基因表達的相互作用對卵巢癌侵襲性的影響。用Sp1（在Thr453和Thr739位點）磷酸化抗體和CD147單抗單獨或聯(lián)合封閉卵巢癌HO-8910細胞系的高轉移株，Transwell實驗發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞的侵襲性降低，提示Sp1-CD147關系環(huán)可以增加卵巢癌的侵襲性。
　　第四部分：檢測Sp1磷酸化與CD147基

10、因在卵巢癌細胞及組織中的表達并分析其相關性。我們運用Western blot方法檢測卵巢癌細胞株SKOV3、HO-8910和HO-8910PM中p-Sp1（Thr453）、p-Sp1（Thr739）和CD147的表達。結果顯示在卵巢癌細胞中Sp1磷酸化蛋白水平和CD147蛋白在三種細胞系中的表達高低具有一致性。之后我們運用免疫組化的方法檢測了53例卵巢癌標本中的p-Sp1（Thr453）、p-Sp1（Thr739）和CD147的表達和分

11、布。結果顯示Sp1的磷酸化蛋白主要表達于卵巢癌的細胞核膜和核內，而CD147主要表達于細胞膜和細胞漿中。CD147的表達情況統(tǒng)計結果示12例(強陽性，22.64%)；15例(陽性，28.30%)；6例(弱陽性，11.32%)；20例(陰性，37.74%) Phospho-Sp1(T453)的表達情況統(tǒng)計結果示24例(強陽性，45.28%)；13例(陽性，24.53%)；7例(弱陽性，13.21%)；9例(陰性，16.98%)而 phos

12、pho-Sp1(T739)的表達情況統(tǒng)計結果示16例(強陽性，30.19%)，14例(陽性，26.42%)，10例(弱陽性，18.87%)；13例(陰性，24.53%)。CD147陽性結果所占比例為62.26%，而 phospho-Sp1(T453)和phospho-Sp1(T739)的陽性表達率分別為83.02%，75.47%。Spearman秩相關分析顯示p-Sp1（Thr453）、p-Sp1（Thr739）和CD147的表達低度相