雞TRAF3、TRAF6基因的克隆、表達(dá)及其在雞抗病毒免疫應(yīng)答過(guò)程中的作用研究.pdf

1、先天免疫作為機(jī)體的第一道防線，在抵抗病原入侵和誘導(dǎo)后天免疫的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。TRAF-3和TRAF-6作為T(mén)RAF家族的兩個(gè)重要成員，其在哺乳動(dòng)物的先天抗病毒免疫過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，但是其是否也參與了雞的先天抗病毒免疫通路呢？本試驗(yàn)首先通過(guò)設(shè)計(jì)特異的引物對(duì)雞的TRAF3、TRAF6基因的CDS區(qū)進(jìn)行克隆;然后通過(guò)定量PCR技術(shù)，分析了TRAF-3和TRAF-6基因在雞心、肝、脾等共11個(gè)組織中表達(dá)分布;接著我們分別轉(zhuǎn)染雙鏈的

2、DNA-Poly(dA∶dT)和雙鏈的RNA-Poly(I∶C)進(jìn)入雞的胚胎成纖維細(xì)胞，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)TRAF3、TRAF6基因及其下游基因在雞胚成纖維細(xì)胞抵抗外源的DNA和RNA免疫過(guò)程中的表達(dá)量的變化;同時(shí)我們采用細(xì)胞攻毒試驗(yàn)，分析了TRAF3、TRAF6基因及其下游基因在雞胚成纖維細(xì)胞感染新城疫病毒后的表達(dá)變化，進(jìn)一步確定其在雞抗病毒免疫過(guò)程中的作用。最后我們選用將80只10日齡SPF白來(lái)航雛雞，分別通過(guò)腹腔注

3、射注射接種0.1ml中等毒力和標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒病毒稀釋液病毒。在感染新城疫病毒后24h、48h、96h進(jìn)行采樣。其中攻毒組每次采樣5只雞，對(duì)照組每次采樣4只雞。每只雞分別采集脾臟、胸腺和法氏囊組織，利用熒光定量的方法進(jìn)一步確定TRAF3、TRAF6基因及其下游基因在雞體內(nèi)抗病毒免疫過(guò)程中的作用。主要研究結(jié)果如下:
　　1)通過(guò)對(duì)雞TRAF3、TRAF6基因進(jìn)行克隆，序列比對(duì)之后得到了TRAF3的2個(gè)預(yù)測(cè)序列和1個(gè)新的序列，TRAF6得到1

4、個(gè)預(yù)測(cè)序列和1個(gè)新的序列。我們發(fā)現(xiàn)雞的TRAF3、TRAF6的蛋白結(jié)構(gòu)與人類(lèi)的蛋白結(jié)構(gòu)相似，猜測(cè)雞的TRAF3、TRAF6基因與人類(lèi)TRAF3、TRAF6基因有相似的功能。
　　2)對(duì)TRAF3、TRAF6基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其在脾臟、肺和胸腺中的表達(dá)量最為豐富，極顯著(p＜0.01)高于其它組織。說(shuō)明TRAF3和TRAF6基因可能主要參與在雞脾臟、肺、胸腺中的先天免疫。
　　3)通過(guò)轉(zhuǎn)染Poly(dA∶dT

5、)和Poly(I∶C)進(jìn)入雞胚成纖維細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)TRAF3、TRAF6及其下游基因表達(dá)量在感染2種模式病毒后，隨著濃度或者感染時(shí)間的增加，TRAF3、TRAF6及其下游基因的表達(dá)都會(huì)有所上調(diào)，而且達(dá)到一定濃度或者時(shí)間時(shí)，其表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)。說(shuō)明TRAF3、TRAF6基因可能參與結(jié)合識(shí)別DNA模式病毒和雙鏈RNA模式病毒的過(guò)程，能夠誘導(dǎo)下游基因產(chǎn)生干擾素和白細(xì)胞介素等來(lái)抵御病原微生物的入侵。而且他們對(duì)于病毒轉(zhuǎn)染后的抗病毒免疫應(yīng)答有濃度與時(shí)

6、間的依賴性。
　　4)在病毒不同MIO及不同NDV感染CEF后，TRAF3/6及其下游基因表達(dá)都有所上調(diào)，在MIO=1時(shí)轉(zhuǎn)染8h或者12h時(shí)，TRAF3/6及其下游基因的極顯著(p＜0.01)表達(dá)。說(shuō)明TRAF3/6參與了抗病毒免疫應(yīng)答機(jī)制過(guò)程，而且對(duì)于病毒有濃度與時(shí)間的依賴性。
　　5)在新城疫病毒感染10日齡SPF白來(lái)航雛雞后，我們發(fā)現(xiàn)小雞的脾臟、胸腺、法氏囊感染不同毒力毒株的NDV后，TRAF3、TRAF6基因及其下游