輪狀病毒G9型(ZTR18)滅活疫苗的免疫學初步評價.pdf

1、背景與目的:輪狀病毒(rotavirus，RV)是引起嬰幼兒秋冬季腹瀉的最重要病原體，全球每年約有1億嬰幼兒感染RV，其中近50萬感染者重癥死亡。迄今為止依據(jù)RV的VP6特性，發(fā)現(xiàn)的輪狀病毒共7個組A～G，其中感染嬰幼兒的主要為A組輪狀病毒。RV的感染與經(jīng)濟和衛(wèi)生條件的差異不明顯，全球各國均有發(fā)生，發(fā)達國家和發(fā)展中國家感染率相似，病死率發(fā)展中國家較高。RV的感染給人類帶來沉重的疾病傷害和經(jīng)濟負擔。目前尚無治療輪狀病毒有效藥物，研制疫苗是

2、預防和控制RV感染、降低死亡率有效途徑。世界衛(wèi)生組織(world health organization，WHO)也積極推動各國政府進行輪狀病毒疫苗的研究與開發(fā)。
　　目前上市的有Rotarix(基因型為G1P[8])、RotaTeq(基因型為G1，G2，G3，G4，G6和P[8])和羅特威(基因型為G10P[12])三種減毒疫苗。這三種減毒疫苗在預防RV感染起到重要作用。減毒疫苗本身也存在一定共性問題，例如可能發(fā)生毒力返祖;疫苗

3、制備過程中的外源因子污染，預存抗體對疫苗有效性的影響;不能用于免疫缺陷或者免疫抑制治療人群等。因此，開發(fā)其他形式的輪狀病毒疫苗是一種新的思路，包括滅活疫苗和亞單位疫苗等。
　　無論研制何種形式的疫苗，研究疾病的流行病學動態(tài)和病原體特征都是非常重要的。自20世紀70年代RV被發(fā)現(xiàn)以來，A組輪狀病毒依據(jù)病毒VP7糖蛋白抗原(G型)特性至少有14個型，VP4蛋白水解酶(P型)特性至少有19個型，基因型與血清型基本一致。流行病學研究表明，

4、在不同地區(qū)和不同時間造成RV流行病毒株基因型是不同的。例如最初流行主要毒株型為G1型，隨后出現(xiàn)G3和G2等病毒株的流行。最近在中國多個地區(qū)的流行病學資料提示，G9型已經(jīng)逐漸成為主要流行型。雖然有關(guān)RV病毒的研究表明，不同型之間有交叉識別和一定水平的交叉保護作用，但不同型的交叉保護能力存在顯著性差異。一般而言，同型的保護效力最高。因此，選擇目前或者未來一段時間內(nèi)主要流行毒株作為疫苗研制的材料，開展RV滅活疫苗的相關(guān)基礎(chǔ)研究具有重要意義。<

5、br>　　方法:1)通過主題詞“輪狀病毒”和“rotavirus”分別在中國知網(wǎng)(CNKI)和Pubmed對2003～2013年進行文獻回顧性檢索，并對采集到的文獻進行流行病學相關(guān)數(shù)據(jù)分析;2)用醫(yī)學生物學研究所分子生物學研究室分離的ZTR18(G9型)野生RV毒株，經(jīng)羅猴胚胎腎傳代細胞(MA104細胞)傳代至第9代，然后進行大規(guī)模培養(yǎng)制備病毒液;3)經(jīng)PAGE檢測基因組電泳條帶型及穩(wěn)定性;4)用RT-PCR-測序檢測VP7基因型;5)

6、用免疫熒光法(FFA)測定病毒感染性滴度;6)通過超濾和QFF、G-25層析等步驟純化病毒;7)用終濃度為0.00925％甲醛，進行72小時37℃滅活;8)經(jīng)細胞病變和熒光灶法檢測殘余活病毒;9)ELISA測定疫苗制備過程中病毒抗原含量(酶標單位EU);10)用Lowry法測定超濾液和疫苗滅活后蛋白質(zhì)含量變化;11)用負染法電鏡觀察滅活前后RV形態(tài)變化;12)選擇SPF級ICR雄性小鼠，按不同免疫劑量從320EU起始，倍比遞減，共分為7

7、個實驗組和一個PBS對照組，每組六只，肌肉注射，共免疫兩次，每次間隔14天;13)用ZTR18(G9型)滅活疫苗和ZTR68(G1型)滅活疫苗，進行雙價滅活疫苗評價，雙價疫苗中兩種單價滅活疫苗均為160EU，采用的實驗動物及免疫程序同12);14)經(jīng)ELISA分析兩種單價滅活疫苗和雙價滅活疫苗免疫小鼠后血清抗體反應;15)用熒光灶抑制實驗(FFIT)檢測三種疫苗誘導的血清抗體對ZTR68(G1型)、Wa(G1型)、S2(G2型)、SA1

8、1(G3型)、Gottfried(G4型)和ZTR18(G9型)中和效價。
　　結(jié)果:1)感染陽性病例數(shù)前三省份為廣東(186587例)，浙江(133390例)和湖北(11104例);2)感染陽性率最多的前三省份是河南(75.20％)、吉林(64.94％)和寧夏回族自治區(qū)(60.16％);3)G型最多的三個是G3(8509例)、G1(6490例)和G2(1601例);4)G型中G9型RV最近幾年呈現(xiàn)病例數(shù)快速增長的態(tài)勢;5)P型最

9、多的前三個是P8(8483例)、P4(2017例)和P6(740例);6)在中國治療主要采用的是疫苗預防結(jié)合臨床對癥治療的方式;7)PAGE證明病毒傳代過程中基因組條帶與原始株相同;8)RT-PCR-測序及序列比對證實病毒傳代過程VP7基因未發(fā)生變異;9)FFA法測定病毒滴度為105.17CCID50/ml;10)ELlSA檢測經(jīng)超濾，純化，滅活后疫苗的抗原含量為1600EU/ml;11)Lowry法測定，病毒收獲液超濾，純化，滅活蛋白

10、質(zhì)含量從收獲液的0.8 mg/ml降為滅活的0.16 mg/ml;12)負染法觀察滅活前后RV形態(tài)，均可見完整的病毒顆粒;13)動物實驗結(jié)果表明，ZTR18(G9型)滅活疫苗以160EU/100μl為最佳免疫劑量。14)ELISA測得雙價滅活疫苗免疫小鼠的血清ELISA效價比ZTR68(G1型)和ZTR18(G9型)兩個單價滅活疫苗的效價高;15)同型和交叉中和實驗結(jié)果表明，雙價輪狀病毒滅活疫苗及兩種單價滅活疫苗免疫小鼠的血清與ZTR6

11、8(G1型)、Wa(G1型)、S2(G2型)、SA11(G3型)、Gottfried(G4型)和ZTR18(G9型)六個RV血清型均有一定交叉中和作用。
　　結(jié)論:1)流行病學研究的提示，G9型RV可能會成為未來RV主要流行型。2)用目前的制備方法可獲得具有良好免疫原性的實驗性疫苗3)雙價滅活疫苗誘導產(chǎn)生的ELISA抗體效價要比單價高;5)抗ZTR68(G1型)和ZTR18(G9型)抗體可中和ZTR68(G1型)、Wa(G1型)、