狼毒中三種雙黃酮與藥物轉運體的相互作用研究.pdf

1、狼毒作為有毒中藥收載于中國藥典2015版，具有毒-效雙重性。藥理學研究顯示，狼毒具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌和免疫活性調節(jié)等作用。但因其安全范圍窄且作用機理不明確，嚴重影響狼毒的臨床應用。狼毒色原酮(CMC)、新狼毒素B(NCB)和新狼毒素A(NCA)是狼毒的主要活性成分。藥物的吸收、分布、代謝、排泄對有毒中藥作用機理的闡明、毒性和有效性的闡釋、安全性的評價具有重要作用。本課題從體外和體內兩個層面，采用人源化高表達藥物轉運體細胞模型、整體動

2、物模型結合計算機分子對接模型，從蛋白-細胞-生物體多個層面系統(tǒng)研究了雙黃酮類化合物CMC、NCB和NCA與藥物轉運體MRP2、BCRP、P-gp和OAT1之間的相互作用。通過細胞轉運、積聚及其抑制實驗，細胞動力學和藥物代謝動力學研究等，闡明它們與藥物轉運體相互作用以及主要成分之間的藥物藥物相互作用的機理，為狼毒的深入開發(fā)和合理應用提供科學依據(jù)。
　　1.LC-MS/MS分析方法的建立和驗證
　　建立了CMC、NCB、NCA（

3、內標法）和拉米夫定（外標法）在三種基質（HBSS、0.1％ SDS細胞破碎液、大鼠血漿）中的LC-MS/MS分析方法，經(jīng)過分析方法學驗證，這些方法的專屬性、線性范圍、定量下限、精密度、準確度、基質效應和樣品穩(wěn)定性等均符合生物樣本中藥物分析方法的要求，同時可滿足本實驗需求，為本課題的研究提供了可靠的測定方法。
　　2.三種雙黃酮與人MRP2、BCRP、P-gp和OAT1相互作用的體外研究
　　采用MDCK-MRP2、LLC-P

4、K1-BCRP、MDCK-MDR1和MDCK-OAT1轉基因細胞模型，研究了三種雙黃酮的轉運機制及其與上述四種藥物轉運體功能的影響。結果表明，NCB為MRP2、P-gp底物，CMC為MRP2、BCRP底物，NCA為BCRP底物。CMC和NCB為MRP2、BCRP和P-gp抑制劑，NCA為MRP2抑制劑。三者均為OAT1的底物和抑制劑。
　　另外，以NCB為代表性化合物，對其作為MRP2、BCRP、P-gp和OAT1的抑制劑進行了抑

5、制機理的探討。RT-qPCR和Western blot的分析表明，NCB抑制P-gp的mRNA和蛋白表達，抑制常數(shù)Ki大于Ki'，屬于競爭性和非競爭性的混合抑制類型。相同的實驗方法證實， NCB對MRP2的抑制為競爭性抑制類型，對OAT1的抑制類型是混合抑制類型。計算機分子對接模型研究表明，NCB作為一種雙黃酮與單黃酮的結構相比，NCB的自由能更低，與P-gp的結合更具有化學結構上的對接優(yōu)勢，對P-gp的抑制更強。
　　3.三種雙

6、黃酮基于轉運體藥物相互作用的體內研究
　　(1) CMC單獨給藥及與NCB聯(lián)合給藥的大鼠藥物代謝動力學研究
　　對CMC單獨給藥(30mg/kg)，CMC和NCB聯(lián)合給藥(30mg/kg CMC和15mg/kgNCB)進行了大鼠體內藥物代謝動力學參數(shù)的比較。與CMC單獨給藥相比，CMC和NCB聯(lián)合給藥后CMC的AUC0-∞和Cmax分別增加了48.9％和81.9％。而體外試驗結果表明CMC是MRP2和BCRP的底物但不是P-

7、gp的外排底物，因此，NCB對腸道外排轉運體MRP2和BCRP的抑制作用是聯(lián)合給藥后CMC生物利用度提高的主要原因之一。
　　(2)狼毒提取物與拉米夫定聯(lián)合用藥后的大鼠藥物代謝動力學研究
　　狼毒和拉米夫定都具有抗病毒的作用，且拉米夫定是OAT1的經(jīng)典底物。拉米夫定與狼毒提取物聯(lián)合給藥后，拉米夫定AUC0-∞和Cmax均有大幅提高。體外試驗結果顯示CMC、NCB和NCA對MDCK-OAT1細胞中的拉米夫定攝取有顯著的抑制作用

8、，因此，推斷其機理是狼毒提取物中的主要成分通過抑制腎臟攝取轉運體OAT1從而增加拉米夫定的血藥濃度。
　　(3)狼毒提取物的藥物代謝動力學研究
　　盡管CMC的含量在提取物中最高，但是大鼠234.5 mg/kg狼毒提取物（按百分含量折算，CMC、NCB和NCA的大鼠口服劑量分別為66.8mg/kg，34.5 mg/kg和33.3mg/kg)口服給藥后，CMC吸收的絕對數(shù)量卻不如NCB，三者AUC0-∞經(jīng)給藥劑量校正后的相對比