狼毒中三種雙黃酮與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的相互作用研究.pdf

1、狼毒作為有毒中藥收載于中國(guó)藥典2015版，具有毒-效雙重性。藥理學(xué)研究顯示，狼毒具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌和免疫活性調(diào)節(jié)等作用。但因其安全范圍窄且作用機(jī)理不明確，嚴(yán)重影響狼毒的臨床應(yīng)用。狼毒色原酮(CMC)、新狼毒素B(NCB)和新狼毒素A(NCA)是狼毒的主要活性成分。藥物的吸收、分布、代謝、排泄對(duì)有毒中藥作用機(jī)理的闡明、毒性和有效性的闡釋、安全性的評(píng)價(jià)具有重要作用。本課題從體外和體內(nèi)兩個(gè)層面，采用人源化高表達(dá)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞模型、整體動(dòng)

2、物模型結(jié)合計(jì)算機(jī)分子對(duì)接模型，從蛋白-細(xì)胞-生物體多個(gè)層面系統(tǒng)研究了雙黃酮類化合物CMC、NCB和NCA與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2、BCRP、P-gp和OAT1之間的相互作用。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、積聚及其抑制實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞動(dòng)力學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究等，闡明它們與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體相互作用以及主要成分之間的藥物藥物相互作用的機(jī)理，為狼毒的深入開發(fā)和合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　1.LC-MS/MS分析方法的建立和驗(yàn)證
　　建立了CMC、NCB、NCA（

3、內(nèi)標(biāo)法）和拉米夫定（外標(biāo)法）在三種基質(zhì)（HBSS、0.1％ SDS細(xì)胞破碎液、大鼠血漿）中的LC-MS/MS分析方法，經(jīng)過分析方法學(xué)驗(yàn)證，這些方法的專屬性、線性范圍、定量下限、精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)和樣品穩(wěn)定性等均符合生物樣本中藥物分析方法的要求，同時(shí)可滿足本實(shí)驗(yàn)需求，為本課題的研究提供了可靠的測(cè)定方法。
　　2.三種雙黃酮與人MRP2、BCRP、P-gp和OAT1相互作用的體外研究
　　采用MDCK-MRP2、LLC-P

4、K1-BCRP、MDCK-MDR1和MDCK-OAT1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型，研究了三種雙黃酮的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及其與上述四種藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的影響。結(jié)果表明，NCB為MRP2、P-gp底物，CMC為MRP2、BCRP底物，NCA為BCRP底物。CMC和NCB為MRP2、BCRP和P-gp抑制劑，NCA為MRP2抑制劑。三者均為OAT1的底物和抑制劑。
　　另外，以NCB為代表性化合物，對(duì)其作為MRP2、BCRP、P-gp和OAT1的抑制劑進(jìn)行了抑

5、制機(jī)理的探討。RT-qPCR和Western blot的分析表明，NCB抑制P-gp的mRNA和蛋白表達(dá)，抑制常數(shù)Ki大于Ki'，屬于競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性的混合抑制類型。相同的實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)， NCB對(duì)MRP2的抑制為競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型，對(duì)OAT1的抑制類型是混合抑制類型。計(jì)算機(jī)分子對(duì)接模型研究表明，NCB作為一種雙黃酮與單黃酮的結(jié)構(gòu)相比，NCB的自由能更低，與P-gp的結(jié)合更具有化學(xué)結(jié)構(gòu)上的對(duì)接優(yōu)勢(shì)，對(duì)P-gp的抑制更強(qiáng)。
　　3.三種雙

6、黃酮基于轉(zhuǎn)運(yùn)體藥物相互作用的體內(nèi)研究
　　(1) CMC單獨(dú)給藥及與NCB聯(lián)合給藥的大鼠藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究
　　對(duì)CMC單獨(dú)給藥(30mg/kg)，CMC和NCB聯(lián)合給藥(30mg/kg CMC和15mg/kgNCB)進(jìn)行了大鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較。與CMC單獨(dú)給藥相比，CMC和NCB聯(lián)合給藥后CMC的AUC0-∞和Cmax分別增加了48.9％和81.9％。而體外試驗(yàn)結(jié)果表明CMC是MRP2和BCRP的底物但不是P-

7、gp的外排底物，因此，NCB對(duì)腸道外排轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2和BCRP的抑制作用是聯(lián)合給藥后CMC生物利用度提高的主要原因之一。
　　(2)狼毒提取物與拉米夫定聯(lián)合用藥后的大鼠藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究
　　狼毒和拉米夫定都具有抗病毒的作用，且拉米夫定是OAT1的經(jīng)典底物。拉米夫定與狼毒提取物聯(lián)合給藥后，拉米夫定AUC0-∞和Cmax均有大幅提高。體外試驗(yàn)結(jié)果顯示CMC、NCB和NCA對(duì)MDCK-OAT1細(xì)胞中的拉米夫定攝取有顯著的抑制作用

8、，因此，推斷其機(jī)理是狼毒提取物中的主要成分通過抑制腎臟攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體OAT1從而增加拉米夫定的血藥濃度。
　　(3)狼毒提取物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究
　　盡管CMC的含量在提取物中最高，但是大鼠234.5 mg/kg狼毒提取物（按百分含量折算，CMC、NCB和NCA的大鼠口服劑量分別為66.8mg/kg，34.5 mg/kg和33.3mg/kg)口服給藥后，CMC吸收的絕對(duì)數(shù)量卻不如NCB，三者AUC0-∞經(jīng)給藥劑量校正后的相對(duì)比