動物源食品中沙拉沙星ELISA快速檢測方法的建立.pdf

1、沙拉沙星(SARA)是新型的動物專用藥，于1995年在美國上市，是美國第一個(gè)被批準(zhǔn)用于動物性食品的氟喹諾酮類藥物，該藥是廣譜抗菌藥。由于其具有良好的殺菌效果、且價(jià)格低廉而被廣泛使用。
　　雖然SARA被批準(zhǔn)用于對大腸桿菌等病菌的治療，但是若氟喹諾酮類藥在動物源食品中殘留而被人食用，可能會加速人類病原體對抗生素耐藥性。國內(nèi)規(guī)定SARA的最高殘留量為80μg/Kg。目前，氟喹諾酮類藥物的檢測的常規(guī)方法包括紫外分光光度測定、高效液相色譜

2、、時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光法等。以上檢測方法的精確度和靈敏度都很高，這些檢測方法需要的設(shè)備比較昂貴，且樣品前期處理較為繁瑣，只能限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測，不能滿足現(xiàn)場快速監(jiān)測食品中殘留的需要，故需建立一種能快速準(zhǔn)確檢測SARA殘留且成本較低的檢測方法。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是一種具有簡便易操作、檢測快，靈敏度和準(zhǔn)確度高，能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測等特點(diǎn)的檢測方法，且成本較低，能夠彌補(bǔ)大型儀器所帶來的不足。近年來隨著 ELISA的不斷發(fā)展，ELISA在農(nóng)藥和獸

3、藥快速檢測方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。
　　建立SARA的ELISA檢測方法需要制備SARA的單克隆抗體，由于SARA是小分子物質(zhì)，屬于半抗原，自身有反應(yīng)原性卻無免疫原性，所以SARA需要與大分子物質(zhì)相結(jié)合，通過人工的方法合成免疫原，SARA才能獲得免疫原性，然后通過免疫小鼠獲得小鼠多抗血清，進(jìn)而制備SARA單克隆抗體和建立ELISA檢測方法。本研究根據(jù)ELISA在檢測方面的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，通過人工合成免疫原SARA-BSA，免疫小鼠而獲得

4、高親和特異性多抗血清，為制備SARA單克隆抗體和建立SARA ELISA檢測方法奠定基礎(chǔ)。
　　1．人工抗原的合成與鑒定
　　采用碳二亞胺法（EDC法），分別將沙拉沙星(SARA)與牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)，制備了免疫原SARA-BSA和包被原SARA-OVA。通過使用紫外掃描法（UV）、SDS-PAGE凝膠電泳對免疫原SARA-BSA和包被原SARA-OVA進(jìn)行了初步鑒定。根據(jù)鑒定結(jié)果，初步證明SAR

5、A人工抗原制備成功。
　　2．單克隆抗體的制備與鑒定
　　選擇多克隆抗體效價(jià)高、特異性好的小鼠進(jìn)行融合，利用單克隆抗體技術(shù)，結(jié)合ELISA篩選體系，最終成功篩選出可以穩(wěn)定產(chǎn)生親和力好、特異性強(qiáng)的抗SARA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2株，其編號分別為1G3、3H3，用體內(nèi)誘生腹水法制備腹水，經(jīng)純化后鑒定，抗體的效價(jià)為1：5.12×105，IC50=6.34ng/mL，親和常數(shù)分別為8.55×108L/mol， SARA抗體與諾氟

6、沙星的交叉反應(yīng)率為1.06％，與同類藥物及其他類藥物的競爭交叉反應(yīng)率均小于0.5％。
　　3．SARA間接競爭ELISA快速檢測試劑盒的組裝
　　利用制備的SARA單克隆抗體和間接競爭ELISA檢測原理，組裝了SARA間接競爭 ELISA試劑盒。試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈典型 S型，相關(guān)線性回歸方程為y=-0.3848x+0.7363，R2為0.9901，根據(jù)回歸方程計(jì)算出IC50=4.11 ng/mL。試劑盒的特異性很好，與其他藥