吉西他濱對(duì)慢粒細(xì)胞G-CSFR及bcr-abl mRNA的影響.pdf

1、目的:
　　隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,核苷類抗代謝物已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研究的重要內(nèi)容。吉西他濱(Gemcitabine,GEM)是一種新型的脫氧胞苷類似物和核苷還原酶抑制劑,屬抗代謝類抗腫瘤藥物,目前已被廣泛應(yīng)用于實(shí)體瘤的治療,因其療效肯定,副作用小已被美國FDA批準(zhǔn)為非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌以及胰腺癌的一線化療藥。
　　國外有關(guān)該藥物對(duì)白血病的治療尚處于基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)階段,國內(nèi)偶見吉西他濱用于難治及復(fù)發(fā)淋巴瘤的報(bào)道,研究表明吉

2、西他濱體外可誘導(dǎo)髓系白血病株HL-60細(xì)胞凋亡,抑制HL-60細(xì)胞系增殖。粒細(xì)胞集落刺激因子(graunlocyte colony-stimulating factor,G-CSF)是一種重要的造血生長因子,它與粒細(xì)胞集落刺激因子受體(G-CSF receptor,G-GSFR)結(jié)合,通過復(fù)雜的信息傳導(dǎo)系統(tǒng),特異地調(diào)節(jié)粒系細(xì)胞的增殖與分化,并增強(qiáng)成熟粒細(xì)胞的功能,在機(jī)體應(yīng)激防御系統(tǒng)中起重要作用。73％-79％的造血干細(xì)胞及93％的造血祖

3、細(xì)胞表面有G-CSFR的存在,且G-CSFR的數(shù)量隨著細(xì)胞的成熟而增加,因此,G-CSFR的表達(dá)在某種程度上反映了細(xì)胞的分化程度。
　　人類成熟的粒細(xì)胞表面有200-1000 R/細(xì)胞,而在幼稚細(xì)胞表面G-CSFR的數(shù)量相對(duì)較少,約為正常粒細(xì)胞的百分之一。慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)病人的BCR/ABL融合基因高表達(dá)可以通過下調(diào)C/EBPalpha抑制骨髓祖細(xì)胞G-CSFR的

4、轉(zhuǎn)錄,造成了CML病人骨髓細(xì)胞G-CSFR的表達(dá)率降低。G-CSFR表達(dá)率的下降能影響G-CSF生理效應(yīng)的發(fā)揮,使細(xì)胞分化障礙;C/EBPalpha可誘導(dǎo)骨髓前體細(xì)胞向粒系分化,它的下調(diào)會(huì)阻止髓系分化,因此C/EBPalpha的下調(diào)和G-CSFR表達(dá)率降低可能導(dǎo)致CML患者骨髓粒系分化障礙,這可能是CML慢性期患者進(jìn)入到急變期的誘因之一。
　　本研究將吉西他濱作用于CML骨髓細(xì)胞,觀察吉西他濱對(duì)CML患者骨髓細(xì)胞BCR/ABL融合

5、基因mRNA及骨髓粒系G-CSFR表達(dá)的作用,為其可能作為新的CML治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),探討應(yīng)用吉西他濱治療白血病的可能性。
　　方法:
　　1.選擇CML慢性期初治患者23例、CML急變期患者8例及正常對(duì)照組10例,每例取骨髓液6ml制備骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液,分為吉西他濱組和未加藥組,吉西他濱組加入吉西他濱,調(diào)整濃度為10μg/ml,用含體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng),置于37℃,5％CO~2飽和濕度的孵箱中培

6、養(yǎng)48h后收集細(xì)胞,未加藥組接種于含體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液(Gibco公司產(chǎn)品)中,置于37℃,5％CO~2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞。
　　2.將收集的細(xì)胞進(jìn)行以下檢測(cè):①流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面G-CSFR的表達(dá);②逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)bcr/abl mRNA的表達(dá)。
　　3.所得結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示,多樣本均數(shù)的比較采用方差分析,以

7、α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。G-CSFR表達(dá)率用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s,％)表示,同時(shí)采用直線相關(guān)性檢驗(yàn)分析G-CSFR與bcr/abl mRNA表達(dá)水平之間有無相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.G-CSFR在各組標(biāo)本中的表達(dá)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示:吉西他濱組CML慢性期、急變期患者骨髓粒系G-CSFR的表達(dá)分別為(50.72±8.57)％和(36.32±4.25)％,正常對(duì)照組G-CSFR的表達(dá)為(59.42±7.62)％;未加藥組

8、CML慢性期、急變期患者骨髓粒系G-CSFR的表達(dá)分別為(45.42±6.52)％和(32.58±5.68)％,正常對(duì)照組G-CSFR的表達(dá)為(58.56±5.54)％。吉西他濱組和未加藥組CML慢性期、急變期骨髓粒系G-CSFR的表達(dá)明顯低于正常人(P<0.05),CML慢性期患者高于急變期(P<0.05)。吉西他濱組CML慢性期、急變期骨髓細(xì)胞G-CSFR的表達(dá)率高于未加藥組(P<0.05),該組正常對(duì)照組G-CSFR的表達(dá)率與未加

9、藥組無明顯差異(P>0.05)。
　　2.bcr/abl mRNA在各組標(biāo)本中的相對(duì)表達(dá)水平逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果顯示:反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后凝膠掃描成像系統(tǒng)照相,定性判斷目的基因相對(duì)參照基因表達(dá)量的變化,電泳結(jié)果經(jīng)凝膠掃描成像系統(tǒng)灰度掃描,定量分析目的基因表達(dá)量的變化,以bcr/abl/β-actin的比值表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。
　　吉西他濱組CML慢性期、急變期患者bcr/abl mRNA的相對(duì)表達(dá)

10、水平分別為0.59±0.15和0.60±0.13;未加藥組CML慢性期、急變期患者bcr/abl mRNA的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.60±0.10和0.63±0.11。吉西他濱組CML慢性期患者bcr/abl mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯低于未加藥組(P<0.05),吉西他濱組CML急變期患者bcr/abl mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯低于未加藥組(P<0.05)。
　　3.G-CSFR與bcr/abl mRNA相對(duì)表達(dá)水平的相關(guān)性分析

11、吉西他濱組與未加藥組CML慢性期、急變期G-CSFR的表達(dá)率與bcr/abl mRNA的相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.G-CSFR在CML慢性期、急變期患者中低表達(dá)。
　　2.CML慢性期G-CSFR的表達(dá)高于急變期。
　　3.在體外培養(yǎng)下吉西他濱可以提高CML慢性期、急變期患者G-CSFR的表達(dá)。4.CML慢性期、急變期患者G-CSFR與bcr/abl mRNA的相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相