瘦素對大鼠脂肪來源干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程及TGF-β1表達的影響.pdf

1、目的：本研究旨在研究瘦素（Leptin）對體外培養(yǎng)的SD大鼠脂肪來源干細(xì)胞（SD rat adipose-derived stem cells，ADSCs）的增殖及由轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming Growth Factor-β1, TGF-β1）誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞（Chondrocytes，CHOs）轉(zhuǎn)化過程中的影響，探討瘦素對增殖及誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程是否具有一定的促進作用。
　　方法：1、SD大鼠脂肪來源干細(xì)胞的獲

2、取及培養(yǎng)：清潔級雄性SD大鼠30只（體質(zhì)量200 g左右），無菌下取腹股溝、睪丸脂肪墊脂肪組織，經(jīng)分離、消化、離心后種瓶培養(yǎng) SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，定期給予換液及傳代。通過倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，根據(jù) MTT測定的吸光度值繪制 SD大鼠脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞P1（第1代）、P3（第3代）、P5（第5代）、P9（第9代）各代的細(xì)胞生長曲線。根據(jù)各代細(xì)胞對數(shù)生長期獲得的吸光度值以及其倍增時間按公式測算各代倍增時間。2.P3 SD

3、大鼠脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞被分為4組：空白組：G0組（完全培養(yǎng)基）；對照組：G1組（誘導(dǎo)培養(yǎng)基、瘦素），G2組（誘導(dǎo)培養(yǎng)基、TGF-β1）；實驗組：G3組（誘導(dǎo)培養(yǎng)基、TGF-β1、瘦素）。誘導(dǎo)培養(yǎng)基定期換液，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡拍攝。根據(jù) MTT法測定各組細(xì)胞進入對數(shù)生長期早期72h、96h、120h吸光度值，繪制各組細(xì)胞的增殖曲線。甲苯胺藍染色法鑒定誘導(dǎo)14d后的ADSCs中軟骨基質(zhì)的表達。Realtime PCR方法對G2

4、、G3組細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白及 TGF-β1的mRNA半定量比較。采用方差分析進行組間均數(shù)比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：1、通過對 ADSCs分離提取，在適宜的體外環(huán)境培養(yǎng)后，定期顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)得到結(jié)果：原代細(xì)胞培養(yǎng)24h后即可見細(xì)胞貼壁;培養(yǎng)7d細(xì)胞擴散增長，成纖維細(xì)胞的生長和螺旋生長。傳代后細(xì)胞貼壁及增殖速度明顯加快。2、根據(jù)MTT法繪制生長曲線：從各代細(xì)胞生長曲線情況可得出，接種后ADSCs在1～

5、3d處于生長停滯期，各代 ADSCs均在在3d進入對數(shù)生長期，第1、3代在6～7d進入平臺期，倍增時間為（47±3）h；第5、9代在5～6d進入平臺期，倍增時間為（49±3）h。3、根據(jù) MTT法比較組間增殖情況：在進入對數(shù)生長期早期72h，G0組與G1組，G3組與G2組比較SD大鼠ADSCs吸光度值的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在進入對數(shù)生長期早期120h G0組與G1組之間SD大鼠ADSCs吸光度值的差異不存在統(tǒng)計學(xué)意義（

6、P＞0.05），G2組與 G3組之間SD大鼠ADSCs吸光度值的差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。4.甲苯胺藍染色結(jié)果：ADSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化至第14 d后，行甲苯胺藍染色檢測，G2、G3組呈現(xiàn)出軟骨基質(zhì)的表型特征。5. Realtime PCR結(jié)果：Ⅱ型膠原 mRNA表達的2（-ΔΔCt）值：設(shè) G2組1.000±0.000，G3組1.613±0.197，結(jié)果顯示 G3組Ⅱ型膠原 mRNA表達水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<