瘦素對(duì)大鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程及TGF-β1表達(dá)的影響.pdf

1、目的：本研究旨在研究瘦素（Leptin）對(duì)體外培養(yǎng)的SD大鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞（SD rat adipose-derived stem cells，ADSCs）的增殖及由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（Transforming Growth Factor-β1, TGF-β1）誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞（Chondrocytes，CHOs）轉(zhuǎn)化過(guò)程中的影響，探討瘦素對(duì)增殖及誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過(guò)程是否具有一定的促進(jìn)作用。
　　方法：1、SD大鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞的獲

2、取及培養(yǎng)：清潔級(jí)雄性SD大鼠30只（體質(zhì)量200 g左右），無(wú)菌下取腹股溝、睪丸脂肪墊脂肪組織，經(jīng)分離、消化、離心后種瓶培養(yǎng) SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，定期給予換液及傳代。通過(guò)倒置相差顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)并拍照，根據(jù) MTT測(cè)定的吸光度值繪制 SD大鼠脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞P1（第1代）、P3（第3代）、P5（第5代）、P9（第9代）各代的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。根據(jù)各代細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期獲得的吸光度值以及其倍增時(shí)間按公式測(cè)算各代倍增時(shí)間。2.P3 SD

3、大鼠脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞被分為4組：空白組：G0組（完全培養(yǎng)基）；對(duì)照組：G1組（誘導(dǎo)培養(yǎng)基、瘦素），G2組（誘導(dǎo)培養(yǎng)基、TGF-β1）；實(shí)驗(yàn)組：G3組（誘導(dǎo)培養(yǎng)基、TGF-β1、瘦素）。誘導(dǎo)培養(yǎng)基定期換液，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察倒置相差顯微鏡拍攝。根據(jù) MTT法測(cè)定各組細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期72h、96h、120h吸光度值，繪制各組細(xì)胞的增殖曲線(xiàn)。甲苯胺藍(lán)染色法鑒定誘導(dǎo)14d后的ADSCs中軟骨基質(zhì)的表達(dá)。Realtime PCR方法對(duì)G2

4、、G3組細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白及 TGF-β1的mRNA半定量比較。采用方差分析進(jìn)行組間均數(shù)比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1、通過(guò)對(duì) ADSCs分離提取，在適宜的體外環(huán)境培養(yǎng)后，定期顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)得到結(jié)果：原代細(xì)胞培養(yǎng)24h后即可見(jiàn)細(xì)胞貼壁;培養(yǎng)7d細(xì)胞擴(kuò)散增長(zhǎng)，成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和螺旋生長(zhǎng)。傳代后細(xì)胞貼壁及增殖速度明顯加快。2、根據(jù)MTT法繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)：從各代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)情況可得出，接種后ADSCs在1～

5、3d處于生長(zhǎng)停滯期，各代 ADSCs均在在3d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第1、3代在6～7d進(jìn)入平臺(tái)期，倍增時(shí)間為（47±3）h；第5、9代在5～6d進(jìn)入平臺(tái)期，倍增時(shí)間為（49±3）h。3、根據(jù) MTT法比較組間增殖情況：在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期72h，G0組與G1組，G3組與G2組比較SD大鼠ADSCs吸光度值的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期120h G0組與G1組之間SD大鼠ADSCs吸光度值的差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

6、P＞0.05），G2組與 G3組之間SD大鼠ADSCs吸光度值的差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4.甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果：ADSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化至第14 d后，行甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)，G2、G3組呈現(xiàn)出軟骨基質(zhì)的表型特征。5. Realtime PCR結(jié)果：Ⅱ型膠原 mRNA表達(dá)的2（-ΔΔCt）值：設(shè) G2組1.000±0.000，G3組1.613±0.197，結(jié)果顯示 G3組Ⅱ型膠原 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<