還原型谷胱甘肽拮抗6羥多巴胺對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的毒性作用.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease PD)是以黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺(dopamine DA)能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性缺失和路易小體形成為特征的一種常見(jiàn)的中老年人神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。服用左旋多巴類制劑的多巴胺替代療法至今仍是最為有效的治療方法，但遠(yuǎn)期療效甚差，出現(xiàn)癥狀波動(dòng)、異動(dòng)癥以及精神癥狀等。 細(xì)胞移植是治療帕金森病的研究熱點(diǎn)之一。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone Marrow Stromal Cells，BMSCs)可誘導(dǎo)分化形

2、成神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞，分泌腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)等多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，為解決細(xì)胞移植的供體帶來(lái)新的途徑。 6-羥多巴胺(6hydroxydopamine，6-OHDA)結(jié)構(gòu)與多巴胺(dopamine，DA)結(jié)構(gòu)相類似，常被

3、誤作為DA攝入DA能神經(jīng)元，產(chǎn)生羥自由基，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合物I并IV等，選擇性地破壞DA能神經(jīng)元，造成DA能神經(jīng)元死亡。 還原型谷胱甘肽(reducedglutathione，GSH)是人類細(xì)胞質(zhì)中自然合成的一種肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，含有巰基(-SH)，廣泛分布于體內(nèi)各器官，在維持細(xì)胞生物功能中有重要作用。作為腦內(nèi)最重要的抗氧化保護(hù)劑，GSH具有清除自由基、保護(hù)線粒體等多種生物學(xué)功能。

4、N-乙酰半胱氨酸(n-acetyl-1-cysteine,NAC)是GSH的前體，含有活性巰基，能轉(zhuǎn)化為GSH，具有清除自由基，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用等多種生物學(xué)功能。 作為帕金森病動(dòng)物模型的常用藥物——6-OHDA對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞是否具有毒性作用，具有抗氧化作用的還原型谷胱甘肽和其前體N-乙酰半胱氨酸是否能減輕6-OHDA對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的毒性作用，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)就此進(jìn)行了研究。 第一部分：還原型谷胱甘肽

5、拮抗6-羥多巴胺對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的毒性作用 目的：探討6羥基多巴胺(6-OHDA)對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)的毒性作用及還原型谷胱甘肽(GSH)對(duì)其的拮抗作用。 方法：取60～90克SD大鼠的的股骨、脛骨以及肱骨BMSCs，體外培養(yǎng)至傳三代。采用MTT法檢測(cè)不同劑量6-OHDA對(duì)細(xì)胞的毒性作用，相同條件下同時(shí)檢測(cè)GSH的細(xì)胞保護(hù)作用。MTT法檢測(cè)分四組：第一組，PBS對(duì)照組，加入等量PBS；第二組，GSH組(終濃度分別為

6、0.5、1、1.5、2.25、3、6、12 mg/m1)；第三組，6-OHDA組(終濃度分別為0.05、0.l mg/m1)；第四組，GSH+6-OHDA組，6-OHDA(0.05 mg/ml)+GSH(0.5、l mg/ml)，6-OHDA(0.1 mg/m1)+GSH(0.5、1 mg/ml)。 結(jié)果：MTT顯示GSH可使傳三代BMSCs活性升高(p<0.05)；6-OHDA可使傳三代BMSCs的活性下降(p<0.05)；G

7、SH干預(yù)能夠提高6-OHDA作用后的傳三代BMSCs的活性(p<0.05)。 結(jié)論：一定劑量的6-OHDA對(duì)BMSCs具有毒性作用。GSH能夠明顯拮抗6-OHDA對(duì)BMSCs的毒性作用。 第二部分：N-乙酰半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞活性的影響 目的：探討N-乙,酰半胱氨酸(NAC)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞活性的影響。 方法：取60～90克SD大鼠的的股骨、脛骨以及肱骨BMSC

8、s，體外培養(yǎng)至傳三代。采用MTT法檢測(cè)NAC和GSSG的細(xì)胞保護(hù)作用。MTT法檢測(cè)分三組：第一組，PBS對(duì)照組，加入等量PBS；第二組，NAC組(終濃度分別為0.0375、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 mg/ml)第三組，GSSG組(終濃度分別為0.05、0.1、0.25、0.5、l、1.5、3、6、12mg/m1)。 結(jié)果：MTT顯示NAC可使傳三代BMSCs活性升高(p<0.05)；氧

9、化型谷胱甘肽濃度為0.05mg/ml時(shí)，GSSG組細(xì)胞活性高于PBS對(duì)照組(P<0.05)。隨著GSSG劑量加大，細(xì)胞活性下降，呈劑量依賴性，當(dāng)GSSG≥1.5mg/ml時(shí)，細(xì)胞活性低于PBS對(duì)照組(p<0.05)。 結(jié)論：一定劑量的NAC能夠明顯升高BMSCs的活性。較低濃度的GSSG升高BMSCs的活性，高濃度的GSSG降低BMSCs的活性。 1.一定劑量的6-OHDA對(duì)BMSCs具有毒性作用。 2.GSH能