阿司匹林酯酶活性及其與阿司匹林抗凝血作用的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：阿司匹林問世已有一百余年。上世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可以通過不可逆的抑制環(huán)氧化酶-1(COX-1)的活性，從而發(fā)揮抗血小板聚集的作用。但是，在長期隨訪中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用阿司匹林治療的相當(dāng)一部分患者在服用阿司匹林后并不能充分地抑制血小板聚集，因此，近年來提出阿司匹林抵抗(aspirin msistauce，AR)的概念。阿司匹林在吸收過程中和吸收后會迅速的被存在于血漿、肝臟及胃粘膜中的阿司匹林酯酶水解為水楊酸，而在體內(nèi)發(fā)揮抗血小板聚集作

2、用的是阿司匹林的原型藥物，被阿司匹林酯酶水解為水楊酸后失去此作用，因此服用阿司匹林后，在體內(nèi)是否發(fā)揮抑制血小板聚集作用、作用強(qiáng)弱以及阿司匹林抵抗現(xiàn)象都可能與人體內(nèi)阿司匹林酯酶活性相關(guān)。本研究的目的是證實(shí)這一相關(guān)性，探討阿司匹林酯酶活性是否是影響阿司匹林抗凝療效及導(dǎo)致阿司匹林抵抗的原因之一，來指導(dǎo)阿司匹林臨床個(gè)體合理化給藥。本課題建立同時(shí)測定血漿中阿司匹林和水楊酸濃度的高效液相色譜法，采用阿司匹林(ASA)與水楊酸(SA)比值SA/(AS

3、A+SA)表示血漿阿司匹林酯酶的活性，并對阿司匹林酯酶體外培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，測定血漿阿司匹林酯酶活性可以為臨床合理用藥提供了科學(xué)依據(jù)。采用健康中國人的血漿為阿司匹林酯酶的酶源來研究該酯酶的動(dòng)力學(xué)特性。測定100例健康中國人血漿中阿司匹林酯酶的活性，考察阿司匹林酯酶活性在中國人群中的分布情況。考察臨床上經(jīng)常與阿司匹林聯(lián)合應(yīng)用的藥物對阿司匹林酯酶的影響，為臨床合理化用藥提供依據(jù)。由于阿司匹林酯酶在人體的肝臟、紅細(xì)胞及胃粘膜中也有分布，但目前

4、尚沒有反映全身阿司匹林酯酶活性的指標(biāo)，因此我們建立阿司匹林酯酶的體內(nèi)活性指標(biāo)，研究阿司匹林酯酶活性與阿司匹林抗凝血療效的相關(guān)性，考察阿司匹林酯酶活性高低，即阿司匹林體內(nèi)的水解速度是否是影響阿司匹林抗凝血療效及導(dǎo)致阿司匹林抵抗的原因之一。 方法：實(shí)驗(yàn)采用Phenomenex C<,18>柱(4.6 mm×150 mm，5 μm．)；島津Shim-pack C<,18>預(yù)柱(4.6ram×10mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.072

5、mmol·L<'-1>磷酸(22：78，v/v)；檢測波長為228 nm；流速：1.0 mL·min<'-1>；柱溫：30℃：進(jìn)樣量20μL，建立了同時(shí)測定血漿中阿司匹林和水楊酸的濃度的方法。以阿司匹林與水楊酸的比值SA/(ASA+SA)表示阿司匹林酯酶的活性，并用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析法對其體外培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化選擇；通過選擇不同的條件，對該酯酶的酶動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行研究：利用建立的阿司匹林酯酶活性的測定方法，測定100名健康中國人血漿中的阿司匹

6、林酯酶活性，繪制概率分布直方圖，觀察該酯酶在中國人群中的分布；在培養(yǎng)體系中不加入和加入臨床上經(jīng)常與阿司匹林合并應(yīng)用的其它藥物(化合物)，測定阿司匹林酯酶的活性變化，考察臨床上聯(lián)合用藥對阿司匹林酯酶的影響。通過利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測定12例健康志愿者口服100mg拜阿斯匹靈后的血漿清除率，來考察某一特定時(shí)間點(diǎn)血漿SAJASA比率與阿司匹林清除率的相關(guān)性，來確定阿司匹林酯酶體內(nèi)活性指標(biāo)，并通過考察阿司匹林酯酶活性與臨床阿司匹林療效指標(biāo)

7、(TXB<,2>、6-keto-PGF<,1a>)之間的相關(guān)性，確定血漿阿司匹林酯酶活性高低是否是影響阿司匹林抗凝血療效及產(chǎn)生阿司匹林抵抗的原因之一。 結(jié)果:采用RP-HPLC法同時(shí)測定血漿中的阿司匹林和水楊酸的濃度，具有快捷有效的樣品前處理，樣品分析時(shí)間少，良好的分離度和可靠性的特點(diǎn)，并且可以克服提取及分析過程對測定的干擾，結(jié)果顯示阿司匹林在0.08～5.12μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，水楊酸在0.05～4.00μg/mL，

8、范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析法對體外培養(yǎng)條件優(yōu)化選擇得出的最佳的培養(yǎng)條件是A<,2>B<,2>C<,3>D<,1>，即以1mmol·L<'-1>阿司匹林，200μL血漿，在pH為7.6的培養(yǎng)液中培養(yǎng)20min。阿司匹林酯酶的米氏常數(shù)Km=429.67nmol·L<'-1>和Vmax=2.56pmol·min<'-1>．mL<'-1>(血漿)，最適反應(yīng)溫度為37℃，培養(yǎng)緩沖液最適pn為7.4，該酶對pn的變化較敏感，對熱極不穩(wěn)

9、定。臨床上經(jīng)常與阿司匹林合用的藥物中，硝苯地平、地爾硫卓、維拉帕米、雙嘧達(dá)莫、卡托普利、美托洛爾、非那西汀、撲熱息痛、川芎嗪等藥物對阿司匹林酯酶活性具有較顯著的抑制作用；而苯巴比妥、卡馬西平、丙戊酸、丹參素鈉、利多卡因等這些藥物對阿司匹林酯酶具有較顯著的誘導(dǎo)作用；辛伐他汀、氫氯噻嗪、咖啡因這些藥物對阿司匹林酯酶的影響不明顯。100名健康受試者的阿司匹林酯酶活性平均值為(0.2167±0.0683)；67名健康男性和33名健康女性的阿司匹

10、林酯酶活性分別為(0.2159±0.0692)和(0.2173±0.0684)，兩者之間無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)?？诜⑺酒チ趾?，經(jīng)過對血漿清除率和各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的水楊酸(SA)和阿司匹林(ASA)的比值的進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，3.5小時(shí)的血漿中的水楊酸和阿司匹林的比值與阿司匹林的口服清除率顯著相關(guān)性最好(r=0.882，P<0.01)，因此可反映阿司匹林酯酶的活性。由此確定的12名志愿者的阿司匹林酯酶活性和AUC<,ASA>與阿

11、司匹林的抗凝血療效指標(biāo)TXB<,2>抑制百分率和TXB<,2>/6-keto-PGF<,1α>的比值的變化存在著顯著地相關(guān)性(分別為r=-0.9408，P<0.001；r=-0.8211，P<0.01和r=0.8037，P<0.01；r=0.7316，P<0.01)．這些相關(guān)性說明阿司匹林酯酶是阿司匹林的抗凝血療效一個(gè)主要的決定因素。 結(jié)論：本研究建立的阿司匹林酯酶活性測定的高校液相法操作簡便、靈敏、快速，可同時(shí)測定血漿中水楊酸

12、和阿司匹林的濃度，適合于在體外測定血漿中的阿司匹林酯酶活性，為國內(nèi)深入開展阿司匹林代謝酶研究開拓了一種新方法。通過對人血漿中的阿司匹林酯酶活性的分析可以發(fā)現(xiàn)阿司匹林酯酶活性對于pH的變化較敏感，而且對熱極不穩(wěn)定。臨床上經(jīng)常與阿司匹林合并使用的某些藥物可對阿司匹林酯酶產(chǎn)生具有較顯著的抑制或誘導(dǎo)作用，因此同時(shí)服用這些藥物時(shí)應(yīng)該謹(jǐn)慎。阿司匹林酯酶活性在中國人群中分布成正態(tài)性，且性別之間無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在阿司匹林酯酶活性，AUC<,ASA>