TGF-β-,2-反義寡核苷酸對兔角膜損傷修復(fù)的影響.pdf

1、目的及意義 眼外傷在臨床上極為常見。角膜由于其解剖和生理特點(diǎn)，位于眼球的最前端，暴露于瞼裂之中，且為一透明而規(guī)則的屈光界面，因而，極易遭受各類外傷的侵襲。角膜創(chuàng)傷愈合后，常遺留瘢痕而形成角膜散光，影響視功能的恢復(fù)和美觀。 角膜創(chuàng)傷的修復(fù)是一系列的動(dòng)態(tài)級聯(lián)過程，通常包括角膜基質(zhì)細(xì)胞，即成纖維細(xì)胞的激活、增生、分化、細(xì)胞因子的釋放、細(xì)胞外基質(zhì)的合成和重建等，此過程是由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子在時(shí)間和空間上高度協(xié)調(diào)而完成的。越來越多

2、的研究表明轉(zhuǎn)化生長因子-beta(Transforming growth factor-B，TGF-β)在機(jī)體傷口愈合過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，其中。TGF-β<,2>是角膜創(chuàng)傷修復(fù)的啟動(dòng)因子，通過調(diào)控TGF-β<,2>的活性可調(diào)控角膜創(chuàng)傷的修復(fù)過程。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔制作角膜穿孔傷模型，設(shè)計(jì)應(yīng)用TGF-β<,2>的反義寡核苷酸(TGF-β<,2> antisenseoligonucleotide,TGF-β<,2> ASON)轉(zhuǎn)染角

3、膜外傷縫合術(shù)后的瘢痕組織，然后通過裂隙燈觀察、HE染色、免疫組化和熒光定量PCR等檢測手段從大體形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞蛋白數(shù)量及基因水平等不同層面觀察分析TGF-β2反義寡核苷酸對TGF-β2的活性的影響，為實(shí)現(xiàn)藥物干預(yù)減少瘢痕形成以控制外傷性角膜散光的設(shè)想提供理論依據(jù)。 材料與方法： (1) FGF-β<,2>反義寡核苷酸(anti-sense oligodeoxynucleotide，ASON)的制備：根據(jù)兔TGF-

4、β2 mRNA序列(Gene bank號AY429466)，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成一段 21 bp 的 ASON，其序列為 5'．AGAAGTTGGCATTATACCCTT-3'，并合成一段錯(cuò)義寡核苷酸(missense oligodeoxynucleotide， MSON) 作為對照，其序列為5'-GCGATCTGGCATTATACCCIT-3'。 (2) 選用清潔級健康無眼病的新西蘭大白兔24只，雌雄兼用，月齡為3

5、個(gè)月。 隨機(jī)分組：實(shí)驗(yàn)組16只，雙眼均制備角膜穿孔傷縫合術(shù)后模型。左眼術(shù)后滴TGF-β<,2> ASON，為TGF-β<,2> ASON組：右眼滴生理鹽水，為生理鹽水組；對照組8只，不做手術(shù)，同樣左眼滴TGF-β<,2>ASON，右眼滴生理鹽水。 標(biāo)本制作：兩組分別于手術(shù)后4、7、14、28天取角膜標(biāo)本，每次6只兔子(實(shí)驗(yàn)組4只，對照組2只)；角膜的三分之一石蠟包埋，三分之二—80℃冰箱中保存。 (3) 裂隙

6、燈觀察 HE染色 免疫組化 Real time PCR檢測 結(jié)果： (1) 裂隙燈觀察：TGF-β<,2> ASON組：球結(jié)膜輕度充血，角膜縫線附近水腫，前房閃輝(0～＋)，虹膜紋理清晰，瞳孔圓居中，眼壓均正常。隨著時(shí)間的延長，眼前段炎癥反應(yīng)逐漸減輕，至術(shù)后1周完全消失。生理鹽水組：角膜明顯水腫，前房閃輝(＋～＋＋)，虹膜紋理不清晰，瞳孔欠圓，眼壓均正常，角膜緣同時(shí)期出現(xiàn)大量新生血管。隨著時(shí)間

7、的延長，眼前段炎癥逐漸減輕，至術(shù)后2周完全消失，但角膜緣新生血管未消退。 (2) HE染色組織病理學(xué)觀察： TGF-β<,2> ASON組：術(shù)后4d上皮細(xì)胞生長1～2層，基質(zhì)層成纖維細(xì)胞體積增大，扁平，數(shù)量增多，平均每個(gè)高倍鏡下9個(gè)染色細(xì)胞；術(shù)后7d，上皮增生4～5層，排列不規(guī)則，基質(zhì)層成纖維細(xì)胞數(shù)目增多，平均每個(gè)高倍鏡下12個(gè)染色細(xì)胞；術(shù)后14d，上皮基本趨于完整，基質(zhì)層成纖維細(xì)胞數(shù)量少；膠原纖維排列疏松。生理鹽水

8、組：術(shù)后4d上皮細(xì)胞生長4～6層，基質(zhì)層成纖維細(xì)胞體積增大，扁平，數(shù)量增多，平均每個(gè)高倍鏡下21個(gè)染色細(xì)胞：術(shù)后7d，上皮增生4～5層，排列不規(guī)則，基質(zhì)層成纖維細(xì)胞數(shù)目增多，平均每個(gè)高倍鏡下18個(gè)染色細(xì)胞；術(shù)后14d，上皮層排列稍有些不規(guī)則，基質(zhì)層成纖維細(xì)胞數(shù)量增生；膠原纖維排列致密紊亂。對照組滴TGF-β<,2> ASON的和生理鹽水的高倍鏡下表現(xiàn)一致。說明TGF-β<,2>ASON對正常角、節(jié)膜無副作用。 (3)免疫組化觀

9、察： ①角膜創(chuàng)傷后，生理鹽水組a-SMA陽性的成纖維細(xì)胞數(shù)術(shù)后4 d達(dá)到高峰，術(shù)后14 d尚有少許a-SMA陽性的成纖維細(xì)胞；TGF-β<,2>ASON組a-SMA陽性的成纖維細(xì)胞數(shù)則術(shù)后7d達(dá)到高峰，術(shù)后14d回到基線水平，隨著造模時(shí)間的延長，a-SMA陽性的成纖維細(xì)胞數(shù)逐漸減少；并且在術(shù)后4d和7d TGF-β<,2>ASON組的a-SMA陽性的成纖維細(xì)胞數(shù)都比生理鹽水組的少，而且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

10、 ②FN：可見TGF-β<,2>ASON組FN染色明顯減弱，呈板層散在分布于角膜傷口周圍的基質(zhì)層內(nèi)；生理鹽水組FN呈濃密板層分布于傷口周圍的基質(zhì)層內(nèi)。 (4)Real time PCR檢測結(jié)果： TGF-β<,2> ASON組中TGF-β<,2>的4d、7d、14d、28d相對表達(dá)量分別為0.0851±0.0028、0.1389±0.0079、0.0753±0.0026、0.0658±0.0007；生理鹽水組中TGF

11、-β<,2> 的4d、7d、14d、28d相對表達(dá)量分別為0.1943±0.0094、0.1915±0.0101、0.1623±0.0090、0.1318±0.0134，同時(shí)期兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 結(jié)論： 1．TGF-β<,2> ASON可特異性的阻斷TGF-β<,2>的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從基因水平抑制TGF-β<,2>mRNA的合成并影響TGF-β<,2>活性，從而調(diào)控角膜損傷修復(fù)的愈合過程，即抑制

12、成纖維細(xì)胞的活化增生、膠原和纖維連接蛋白等ECM的堆積，從而發(fā)揮抗瘢痕化的作用。 2．角膜損傷縫合術(shù)后成纖維細(xì)胞移行、增生最活躍的時(shí)期是術(shù)后4 d～7 d，14 d左右基本恢復(fù)到基線水平。TGF-β<,2>反義寡核苷酸對a-SMA陽性的成纖維細(xì)胞數(shù)明顯的抑制作用也是在術(shù)后的14天以內(nèi)。因此，從理論上講具備了既促進(jìn)角膜愈合又有抑制角膜瘢痕形成的雙重作用，在角膜損傷修復(fù)這個(gè)動(dòng)態(tài)級聯(lián)過程的早期，即術(shù)后14 d內(nèi)進(jìn)行干預(yù)調(diào)控是減少術(shù)后