鎖式探針滾環(huán)擴(kuò)增方法在小鼠F9單細(xì)胞基因表達(dá)研究中的應(yīng)用.pdf

1、基因表達(dá)檢測與分析是研究細(xì)胞功能的重要手段之一,但傳統(tǒng)的分析方法通常是以細(xì)胞群體為研究對象,得到的是細(xì)胞群體mRNA的整體或平均表達(dá)水平,缺少針對單細(xì)胞中mRNA定位和定量分析的有效手段。鎖式探針滾環(huán)擴(kuò)增(Padlockrolling-circle amplifiction,Padlock-RCA)原位檢測技術(shù)是基于鎖式探針與單鏈DNA靶點的特異性結(jié)合,連接轉(zhuǎn)換為環(huán)形分子后滾環(huán)擴(kuò)增原位檢測單鏈DNA靶點。該技術(shù)具有高特異性和高敏感性,能

2、定位和定量分析單細(xì)胞內(nèi)DNA靶點,因此與PCR和傳統(tǒng)原位雜交技術(shù)相比有明顯優(yōu)勢。Padlock-RCA是一系列反應(yīng)的整合,首先,利用特異的鎖核酸(Locked nucleic acid,LNA)與mRNA結(jié)合,可在細(xì)胞內(nèi)原位將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過RNase H將mRNA降解的同時,鎖式探針(Padlock probe)與新合成的cDNA中靶序列結(jié)合,并通過連接酶的作用,鎖式探針自連環(huán)化,形成單鏈環(huán)化模板。隨后在Phi29聚合酶

3、的作用下,對環(huán)化產(chǎn)物進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增(RCA),最后熒光探針與擴(kuò)增產(chǎn)物上的靶序列特異性結(jié)合,從而實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)水平的檢測。Padlock-RCA對組織細(xì)胞中含量極低的mRNA有極高的敏感性,能夠在單細(xì)胞水平檢測mRNA的表達(dá),因此可以實現(xiàn)在細(xì)胞群體中發(fā)現(xiàn)某些基因特異表達(dá)的罕見細(xì)胞和細(xì)胞亞群。
　　 本研究的目的就是優(yōu)化并利用鎖式探針滾環(huán)擴(kuò)增方法對小鼠畸胎瘤細(xì)胞F9單個細(xì)胞中的基因表達(dá)進(jìn)行原位檢測。研究主要包括四個部分,首

4、先建立滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增的方法,通過對隨機(jī)引物,Phi29聚合酶,擴(kuò)增時間等方面的條件摸索,建立了穩(wěn)定、高效的滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增體系；其次,優(yōu)化鎖式探針滾環(huán)擴(kuò)增方法并檢測小鼠畸胎瘤細(xì)胞F9單細(xì)胞中Nanog基因及Per1基因的表達(dá)；而后利用維甲酸(RA)誘導(dǎo)小鼠畸胎瘤細(xì)胞F9分化模型,對細(xì)胞分化前后Nanog基因mRNA表達(dá)水平的改變進(jìn)行分析；最后將F9細(xì)胞通過皮下注射,接種到129SV小鼠體內(nèi),待成瘤后,將畸胎瘤組織制備冰凍切片,利用Padloc