維甲酸(RA)誘導(dǎo)F9干細(xì)胞分化過程中甲胎蛋白基因表達(dá)及其甲基化.pdf

1、[背景和目的]
　　甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是胚胎期主要的血清蛋白,產(chǎn)生于胎肝和卵黃囊。它在胚胎中的濃度很高,出生后迅速降低,到成人期幾乎檢測不到。由于AFP基因組織和發(fā)育的特異性表達(dá),可作為研究真核基因調(diào)控的典型模型。甲胎蛋白基因的調(diào)控主要是轉(zhuǎn)錄水平的,而DNA甲基化是基因表達(dá)調(diào)控中一種常見而又重要的機(jī)制,弄清甲基化對甲胎蛋白基因表達(dá)的調(diào)控有著重要意義。在AFP基因及其調(diào)節(jié)區(qū)的甲基化與AFP基因表達(dá)

2、的相關(guān)性顯示出相反的結(jié)果。在胚胎和成人肝細(xì)胞中,AFP的表達(dá)水平和該結(jié)構(gòu)基因的去甲基化水平?jīng)]有顯示出明顯的相關(guān)性。只有存在于AFP基因5’端和第1個外顯子的少數(shù)幾個關(guān)鍵位點(diǎn)的甲基化水平與AFP基因活性表現(xiàn)出相關(guān)性。F9干細(xì)胞是來源于小鼠畸胎瘤的胚胎干細(xì)胞。當(dāng)懸浮培養(yǎng)F9細(xì)胞并用RA處理時,F9細(xì)胞聚集成細(xì)胞團(tuán),并且在細(xì)胞團(tuán)外圍的大多數(shù)細(xì)胞會分化成內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞,同時產(chǎn)生AFP作為一個分化分子標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)以RA誘導(dǎo)F9干細(xì)胞分化產(chǎn)生AFP

3、,用RT-PCR檢測AFP表達(dá)水平的變化,同時檢測AFP基因及上游調(diào)控區(qū)的甲基化水平,以尋找兩者的相關(guān)性,確定與AFP表達(dá)存在相關(guān)性的關(guān)鍵性甲基化位點(diǎn)。
　　[材料和方法]
　　1.誘導(dǎo)F9細(xì)胞分化,建立F9細(xì)胞分化模型,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)變化。
　　2.半定量RT-PCR檢測AFP mRNA的表達(dá)變化,電泳后進(jìn)行灰度值分析,得出F9細(xì)胞分化過程中的相對表達(dá)量。
　　3.MSP檢測不同位點(diǎn)在不同分

4、化階段的甲基化狀況,甲基化位點(diǎn)處于基因的不同位置,包括基因上游啟動子區(qū)、非啟動子區(qū)以及基因內(nèi)含子中。
　　[結(jié)果]
　　1. F9細(xì)胞經(jīng)過RA處理后,細(xì)胞最終形成簡單擬胚體:細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)分層,外層為大的細(xì)胞界限清楚的內(nèi)胚層樣細(xì)胞,中間為一層基底膜,基底膜里包裹的是細(xì)胞界限不清楚的未分化的緊密細(xì)胞。這些是F9分化的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。
　　2.AFP在F9細(xì)胞分化過程中表達(dá)出現(xiàn)變化,第0天到3天AFP不表達(dá),第4天到10天開始表達(dá)

5、并成增加趨勢,在第10天表達(dá)量最高,到第11天表達(dá)量大大減少,第12天幾乎不表達(dá)AFP。
　　3.不同位點(diǎn)在不同時間的甲基化狀態(tài)不一:甲基化位點(diǎn)1和甲基化位點(diǎn)5在不同時間的甲基化狀態(tài)不變,甲基化位點(diǎn)1均為非甲基化,甲基化位點(diǎn)5均為甲基化;而甲基化位點(diǎn)2、甲基化位點(diǎn)3和甲基化位點(diǎn)4在不同時間的甲基化狀態(tài)出現(xiàn)不同程度的改變,其中以甲基化位點(diǎn)2和甲基化位點(diǎn)3變化最明顯,與AFP的表達(dá)變化呈現(xiàn)一定的關(guān)系,在AFP表達(dá)開始出現(xiàn)的第3、4兩天

6、,甲基化程度有所下降。
　　[結(jié)論]
　　1.成功建立RA誘導(dǎo)F9干細(xì)胞分化模型。從形態(tài)上觀察,F9細(xì)胞形成簡單擬胚體。而AFP的誘導(dǎo)表達(dá)更加證實(shí)了F9細(xì)胞分化模型的成功建立。
　　2.位于AFP基因上游CpG島的甲基化位點(diǎn)1以及位于AFP基因上游非啟動子區(qū)的甲基化位點(diǎn)5在 AFP誘導(dǎo)表達(dá)的過程中甲基化狀態(tài)保持不變,甲基化位點(diǎn)1均為非甲基化,甲基化位點(diǎn)5均為甲基化,提示甲基化位點(diǎn)1和甲基化位點(diǎn)5的甲基化狀態(tài)與AFP的表

7、達(dá)不相關(guān)。
　　3.位于AFP基因上游CpG島的甲基化位點(diǎn)2的甲基化狀態(tài)在AFP誘導(dǎo)表達(dá)的過程中變化明顯:在AFP mRNA未檢測出的第0天到第3天甲基化程度較高,在隨后的誘導(dǎo)過程中,AFP mRNA明顯上調(diào),甲基化程度與之前相比明顯下降。該位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)與AFP的表達(dá)存在明顯的相關(guān)性。
　　4.位于AFP基因第一個內(nèi)含子的甲基化位點(diǎn)3的甲基化狀態(tài)與AFP基因的表達(dá)存在一定的聯(lián)系。此位點(diǎn)由甲基化到非甲基化的轉(zhuǎn)變能促進(jìn)本來沉