野生型抑癌基因KLF6對激素依賴型前列腺癌的作用研究.pdf

1、【目的】探討野生型抑癌基因KLF6對激素依賴型前列腺癌LNCaP細胞的生長增殖、粘附能力、細胞周期、誘導(dǎo)凋亡、p21蛋白表達、侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化和影響等，進一步證明抑癌基因KLF6在前列腺癌的發(fā)生和進展方面是否扮演著關(guān)鍵性的作用，探討分析野生型抑癌基因作用于前列腺癌的內(nèi)在作用機理，探討野生型抑癌基因KLF6是否可用于激素依賴型前列腺癌的治療及其效果。 【材料和方法】將未轉(zhuǎn)染野生型KLF6和轉(zhuǎn)染野生型KLF6后的激素依賴型前列腺癌

2、LNCaP細胞分別培養(yǎng)48h后加入5g/L濃度的MTT孵育4h，再加入二甲基亞砜(DMSO)，混勻后于酶標儀在490nm波長測定吸光度(A)。細胞生長抑制率=(1-實驗孔測定值/對照孔測定值)×100％。將未轉(zhuǎn)染野生型KLF6和轉(zhuǎn)染野生型KLF6后的激素依賴型前列腺癌LNCaP細胞分別接種于覆蓋了纖維粘連蛋白的細胞培養(yǎng)板孵育2h，去掉培養(yǎng)液加入MTT液培養(yǎng)4 h，加入DMSO用酶標儀在570 nm波長處測定，記錄吸光度值(0D)，按細胞

3、粘附率=實驗組OD值/對照組OD值×100％計算轉(zhuǎn)然前后依賴型前列腺癌LNCaP細胞的粘附率變化。將未轉(zhuǎn)染野生型KLF6和轉(zhuǎn)染野生型KLF6后的激素依賴型前列腺癌LNCaP細胞消化分離為1×10m<'4>/ml的單細胞懸液離心沉淀，70％乙醇固定，Triton X-100和Rnase處理后，行碘化丙錠染色，流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染野生型KLF6前后LNCaP細胞DNA含量變化和凋亡情況。將未轉(zhuǎn)染野生型KLF6和轉(zhuǎn)染野生型KLF6后的激素依賴型

4、前列腺癌LNCaP細胞與鼠抗人p21的單克隆第一抗體混合孵育30min，離心PBS洗滌后加入熒光標記的羊抗鼠單克隆第二抗體，室溫孵育30 min形成p21抗原-抗體-二抗復(fù)合物，PBS洗滌并1％多聚甲醛固定后用流式細胞儀進行分析轉(zhuǎn)染野生型KLF6前后前列腺癌LNCaP細胞p21的表達程度變化。將未轉(zhuǎn)染野生型KLF6和轉(zhuǎn)染野生型KLF6后的激素依賴型前列腺癌LNCaP細胞分別接種于覆蓋了纖維粘連蛋白的細胞培養(yǎng)板，待細胞完全貼壁生長旺盛時用

5、細胞刮子于細胞培養(yǎng)孔內(nèi)側(cè)底面的中部均勻直線劃一條細胞刮除帶，繼續(xù)培育12h、24h后分別計數(shù)劃痕區(qū)域內(nèi)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染野生型KLF6的前列腺癌LNCaP細胞爬行數(shù)目。將未轉(zhuǎn)染野生型KLF6和轉(zhuǎn)染野生型KLF6后的激素依賴型前列腺癌LNCaP細胞接種于包被了微孔PVPF膜的Transwell小室的上室，下室加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h后取出Transwell小室檢測穿過人工基底膜的轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染野生型KLF6的激素依賴型前列腺癌細胞數(shù)目。所有實驗數(shù)據(jù)

6、均以均數(shù)±標準差(x±s)表示，結(jié)果應(yīng)用成組比較t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。 【結(jié)果】細胞增殖抑制實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了野生型抑癌基因KLF6后的前列腺癌LNCaP細胞的生長抑制率為(31.9±4.7)％，未轉(zhuǎn)染抑癌基因KLF6的對照組前列腺癌LNCaP細胞生長抑制率為(5.6±0.9)％，轉(zhuǎn)染野生型抑癌基因KLF6前后的前列腺癌LNCaP細胞的生長抑制率比較有顯著性的差異(P<0.01)。轉(zhuǎn)染了野生型抑癌基因KLF6后的前列腺癌細胞增殖率

7、為(69.1±8.6)％，未轉(zhuǎn)染野生型抑癌基因KLF6的前列腺癌LNCaP細胞生長增殖率為(94.4±11.2)％，轉(zhuǎn)染了野生型抑癌基因KLF6前后的LNCaP細胞增殖、抑制率變化有顯著性的差異(P<0.01或0.05)。細胞粘附實驗結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染野生型抑癌基因KLF6的前列腺癌LNCaP細胞溶液的吸光度值為0.42±0.6，其同時作為自身對照組計算得到未轉(zhuǎn)染的LNCaP細胞組的相對粘附率為(100.0±0.0)％。轉(zhuǎn)染了野生型抑癌基因

8、KLF6后的前列腺癌LNCaP細胞組溶液的吸光度值為0.69±0.8，計算得到轉(zhuǎn)染抑癌基因KLF6后的前列腺癌LNCaP細胞的相對粘附率為(164.3±17.8)％，轉(zhuǎn)染野生型抑癌基因KLF6前后的激素依賴型前列腺癌LNCaP細胞的粘附率比較有顯著性的差異(P<0.05)。流式細胞儀定量檢測表明轉(zhuǎn)染野生型KLF6后的LNCaP細胞生長48 h后出現(xiàn)較為明顯的凋亡峰=(29.3±3.7)％，與對照組凋亡率(8.6±0.9)％比較差異有統(tǒng)計

9、學(xué)意義(P<0.01)。轉(zhuǎn)染野生型KLF6后48 h前列腺癌LNCaP細胞的G<'0>/G<,1>期比例占(75.0±8.8)％，對照組G<,0>/G<,1>期比例為(55.9±7.1)％，表明野生型抑癌基因KLF6作用后的LNCaP細胞的細胞周期阻滯以G<,0>/G<,1>期為主。流式細胞免疫熒光抗體標記實驗檢測表明轉(zhuǎn)染野生型抑癌基因KLF6后的LNCaP細胞在生長48 h時p21的表達率：(82.2±9.8)％，與轉(zhuǎn)染野生型抑癌基因

10、KLF6前的LNCaP細胞在生長48h時的對照組p21表達率=(18.3±3.7)％比較，轉(zhuǎn)染前后兩組細胞p2l表達率的差異有顯著性意義(P<0.01)。劃痕法實驗組顯示轉(zhuǎn)染野生型KLF6后的前列腺癌LNCaP細胞在生長12h、24h后的爬行覆蓋劃痕區(qū)域內(nèi)細胞數(shù)目分別為(42.5±4.1)/mm<'2>、(102.8±15.4)/mm<'2>，與同等條件下未轉(zhuǎn)染野生型抑癌基因KLF6基因的對照組的生長12h、24h后的前列腺癌LNCaP

11、細胞爬行覆蓋劃痕區(qū)域內(nèi)細胞數(shù)目(67．7±7．3)/mm<'2>、(192．7±25．2)/mm<'2>比較，兩組在12h、24h時爬行覆蓋劃痕區(qū)域內(nèi)的細胞數(shù)目均有顯著性差異(P<0．05)。侵襲重組基底膜法觀察結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了野生型抑癌基因KLF6后的激素依賴型前列腺癌LNCaP細胞在生長12h時對transwell重組基底膜的微孔的穿越細胞侵襲數(shù)=(9．8±3．2)/視野，與同等條件下未轉(zhuǎn)染野生型抑癌基因KLF6的對照組生長12h時的

12、前列腺癌LNCaP細胞的transwell重組基底膜的微孔細胞穿越侵襲數(shù)=(24．6±6．5)/視野比較，轉(zhuǎn)染前后的兩組細胞侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)目具有顯著性差異(P<0．01)。 【結(jié)論】轉(zhuǎn)染野生型抑癌基因KLF6后激素依賴型前列腺癌LNCaP細胞的生長增殖受到了顯著的抑制，說明轉(zhuǎn)染野生型抑癌基因KLF6可以抑制前列腺癌細胞的過度增長。LNCaP細胞的粘附能力顯著增加，野生型抑癌基因KLF6可以阻止激素依賴型前列腺癌細胞的原位脫落和轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)

13、染野生型KLF6后激素依賴型前列腺癌LNCaP細胞出現(xiàn)了顯著的凋亡，說明轉(zhuǎn)染野生型抑癌基因KLF6可以誘導(dǎo)前列腺癌LNCaP細胞的凋亡。轉(zhuǎn)染野生型KLF6后激素依賴型前列腺癌LNCaP細胞的細胞周期分布主要表現(xiàn)在G<,0>/G<,1>期細胞比例顯著增加，S期和G<,2>/M期細胞比例顯著減少，說明野生型抑癌基因KLF6誘導(dǎo)的細胞周期阻滯以G<,0>/G<,1>期為主，顯示野生型KLF6可能是通過將前列腺癌細胞的細胞周期阻滯在G<,0>/

14、G<,1>期的機制來誘導(dǎo)凋亡和發(fā)揮其抑制腫瘤生長增殖的抗癌作用。轉(zhuǎn)染了野生型抑癌基因KLF6后的激素依賴型前列腺癌LNCaP細胞的細胞p21蛋白表達顯著上調(diào)，提示轉(zhuǎn)染野生型KLF6后細胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生很可能與p21的上調(diào)有關(guān)，野生型抑癌基因KLF6的表達很可能導(dǎo)致觸發(fā)激活p21的表達，p21基因很可能是野生型KLF6基因的下游的重要的功能基因。轉(zhuǎn)染野生型抑癌基因KLF6后激素依賴型前列腺癌LNCaP細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著下降，