蛋雞肉雞成肌細(xì)胞差異蛋白鑒定及OXCT1基因功能的初步探討.pdf

1、研究肌肉發(fā)生對于理解動物生長發(fā)育過程具有重要意義。蛋雞和肉雞是長期選育過程中形成的兩大品系，它們在骨骼肌生長速率上存在顯著差異。本研究以蛋雞和肉雞的肌肉發(fā)生為模型，分離蛋雞、肉雞的成肌細(xì)胞，采用雙向電泳(2-D)的方法尋找在肉雞和蛋雞成肌細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，并對發(fā)現(xiàn)的差異基因進(jìn)行初步功能研究，為解釋蛋雞、肉雞的骨骼肌表型差異提供了重要線索，并為研究器官的尺寸控制奠定了一定基礎(chǔ)。 通過分析蛋雞、肉雞的成肌細(xì)胞總蛋白雙向電泳結(jié)果，

2、發(fā)現(xiàn)8個在蛋雞和肉雞成肌細(xì)胞中表達(dá)明顯差異的蛋白；而且，其表達(dá)水平均為肉雞高于蛋雞。通過LC-ESI質(zhì)譜分析鑒定，這些差異表達(dá)蛋白分別是OXCT1 protein：capping protein(actin filament)muscle Z-line，alpha 2；PREDICTED：similar to Rbm6 protein：PREDICTED： similar to prohibitin[Gallus gallus]；tum

3、or protein，translationally-controlled 1；acidic ribosomal phosphoprotein：PREDICTED：similar to Dihydroxyacetone：以及phosphate acyltransferase(DHAP)。 以Real-Time PCR驗(yàn)證上述雙向電泳方法獲得的差異表達(dá)蛋白在mRNA水平上的表達(dá)差異，結(jié)果顯示其中的4個蛋白：OXCT1 protei

4、n；PREDICTED：similar to Rbm6 protein；PREDICTED：similar to calmodulin-like 4和tumor protein， translationally-controlled 1，其mRNA水平也是肉雞中的表達(dá)高于蛋雞。 OXCT1，即琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(3-oxoacid CoA transferase 1)，是酮體代謝的關(guān)鍵酶，可以分解酮體為骨骼肌、心肌和腎臟等肝外組

5、織提供能量，考慮到細(xì)胞的增殖與代謝狀態(tài)之間存在著密切的相關(guān)性，我們推測OXCT1的表達(dá)差異可能與蛋雞、肉雞骨骼肌生長發(fā)育差異有關(guān)，所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中主要研究了OXCT1的功能。 我們通過原核表達(dá)、純化雞OXCT1蛋白并免疫小鼠，已經(jīng)獲得了可特異性識別雞OXCT1的抗體。通過Real-Time PCR、Western blot和酶活性分析等不同檢測手段，研究了在蛋雞、肉雞不同發(fā)育階段的骨骼肌組織中，OXCT1在mRNA水平、蛋白水平

6、及酶活性水平的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肉雞骨骼肌中的OXCT1水平均明顯、而且持續(xù)地高于蛋雞，這些結(jié)果均強(qiáng)烈支持OXCT1與蛋雞、肉雞之間顯著的表型差異之間存在著明確的相關(guān)性。細(xì)胞的增殖、分化過程都需要依賴于代謝所提供的能量和底物，考慮到OXCT1在代謝調(diào)節(jié)中的重要地位，推測其可能通過促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖與分化、或骨骼肌蛋白質(zhì)合成來參與肌肉肥大的調(diào)節(jié)。我們進(jìn)一步檢測了蛋雞、肉雞不同發(fā)育階段血清中的OXCT1的底物，3-羥基丁酸(3-hydroxyb

7、utyrate，3-HB)的水平差異(3-HB是酮體的三大組成部分之一，其水平可直接反映酮體水平)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：成年肉雞血清中的3-HB水平確實(shí)高于蛋雞；但是，在胚胎期肉雞的血清3-HB水平卻明顯低于蛋雞，與肉雞骨骼肌OXCT1水平的持續(xù)增高并不一致，這提示肉雞出生之前的酮體利用可能多于蛋雞。 通過在蛋雞成肌細(xì)胞過表達(dá)OXCT1，以及對肉雞成肌細(xì)胞中的OXCT1進(jìn)行RNAi，來觀察OXCT1表達(dá)變化對這兩種成肌細(xì)細(xì)胞表型的影響。雖

8、然OXCT1過表達(dá)或RNAi時并未觀察到對這兩種細(xì)胞表型有明顯影響，但以流式細(xì)胞術(shù)(FACS)進(jìn)一步分析了OXCT1表達(dá)差異對細(xì)胞周期的影響，結(jié)果提示OXCT1過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞DNA合成。 本研究結(jié)果表明，對于尋找蛋雞與肉雞成肌細(xì)胞差異表達(dá)基因，以雙向電泳為基礎(chǔ)的蛋白組學(xué)分析是一種行之有效的方法。更為重要的是，我們關(guān)于OXCT1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為細(xì)胞的增殖、分化過程與細(xì)胞的代謝狀態(tài)之間建立了密切的聯(lián)系，也為進(jìn)一步闡明蛋雞和肉雞骨骼肌