關于人皮膚真皮和角質(zhì)上皮細胞以及在體創(chuàng)傷模型的研究.pdf

1、長久以來，創(chuàng)傷愈合一直是困擾醫(yī)學界的一個永恒的主題。對每天都要處理諸如皮膚缺損，大面積燒傷，以及閉合傷口等相關問題的整形外科醫(yī)生來說，理解并促進創(chuàng)傷愈合的過程尤為重要。創(chuàng)傷愈合是一個需要多種類型細胞參與的復雜過程，包括炎癥發(fā)生，傷口重新上皮化，創(chuàng)區(qū)新生組織形成，以及再生的組織結構重塑，這些過程按照一定的空間和時間的順序有條不紊地進行。其中，真皮成纖維細胞和表皮角質(zhì)上皮細胞是創(chuàng)傷愈合過程中的主要功能細胞。成纖維細胞在信號的引導下，向傷口遷

2、移，分泌細胞外基質(zhì)，進行膠原排列，并收縮傷口，促進愈合。上述細胞的非正常運動可以導致傷口延遲愈合甚至愈合失敗，或者傷口愈合后出現(xiàn)增殖性瘢痕。因此，控制創(chuàng)傷愈合過程中成纖維細胞的細胞遷移運動至關重要。另一方面，在治療燒傷和其他創(chuàng)面時，為了迅速覆蓋創(chuàng)面，往往需要應用培養(yǎng)的角質(zhì)上皮細胞，以促進創(chuàng)傷愈合。另外，在基因療法，藥理學應用策略以及同真皮代用品共同構建人工皮膚方面都需要應用培養(yǎng)的角質(zhì)上皮細胞。要達成這樣的目的，就需要一個可靠而有效的方法

3、來體外培養(yǎng)角質(zhì)上皮細胞，而目前的技術往往不盡人意。因此，該論文將研究真皮成纖維細胞在創(chuàng)傷環(huán)境中的遷移運動和發(fā)展一種可靠的角質(zhì)上皮細胞獲取及培養(yǎng)技術作為主要研究目的，并進一步在裸鼠動物模型上創(chuàng)建一個體外的在體人皮膚創(chuàng)傷愈合模型以供研究未來的細胞和藥物療法對創(chuàng)傷愈合產(chǎn)生的作用。該論文從結構上分為三個獨立的單元，每個部分的摘要簡述如下:
　　 第一章:
　　 應用于臨床治療和實驗室研究的人體的原代培養(yǎng)的角質(zhì)上皮細胞，一般是通過

4、傳統(tǒng)的組織分離技術獲得的。然而，這種技術的應用通常需要依賴于飼養(yǎng)層細胞的支持，用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液通常也不能明確定位。而且，角質(zhì)上皮細胞培養(yǎng)中通常存在真皮成纖維細胞污染的問題。當前，各國的研究者們一直在試圖尋找一種可以從人體皮膚提取純化的角質(zhì)上皮細胞的方法，而這些細胞最好富含表皮干細胞或者祖細胞。這里，我們發(fā)展了一種創(chuàng)新技術，即應用皮膚外植體進行角質(zhì)上皮細胞的原代培養(yǎng)。已證明這種新方法可以在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量角質(zhì)上皮細胞，并且操作簡單，效

5、果穩(wěn)定可靠，獲得的細胞中沒有成纖維細胞的污染。在皮膚外植體的培養(yǎng)過程中，我們觀察到成纖維細胞和角質(zhì)上皮細胞游出外植體的時間有明確的先后順序，即成纖維細胞要比角質(zhì)上皮細胞的游出延遲3-4天左右。我們就利用這一時間差，在培養(yǎng)初始的第3-4天，首先應用胰蛋白酶收獲角質(zhì)上皮細胞外生細胞層。我們隨后將這些角質(zhì)上皮細胞傳代培養(yǎng)在特定的規(guī)范化培養(yǎng)液中，而脫離了對飼養(yǎng)層細胞的依賴。同傳統(tǒng)的分離方法得到的角質(zhì)上皮細胞相比，前者在培養(yǎng)中顯示出更加快速的生長

6、速率和更強大的細胞群落形成特性。而且，在細胞傳代生長能力的比較中，分離方法取得的角質(zhì)上皮細胞不能傳代到3代以上，而應用皮膚外植體方法獲得的細胞可以傳代至第10代，且未見細胞分化。
　　 為了進一步研究這些角質(zhì)上皮細胞的細胞學特性，我們首次應用抗體標記染色的方法來檢測皮膚外植體產(chǎn)生的外生性細胞層以及傳代細胞的細胞組成。我們應用了一系列干細胞/祖細胞標記物免疫染色來檢測各種相關抗體的標記情況。結果顯示，皮膚外植體衍生的角質(zhì)上皮細胞含

7、有高比例的表皮基底膜干細胞/祖細胞標記角質(zhì)蛋白15(K15)陽性表達細胞，極少量的細胞表達細胞分化標記，角質(zhì)蛋白10(K10)。K15是目前所知的表皮干細胞的標記之一。對收獲前的皮膚外植體外生細胞層的免疫染色更進一步展示了這些細胞表達干細胞/祖細胞活性相關的標記，包括造血干細胞/祖細胞標記CD34;表皮干細胞/祖細胞標記CD133以及p63等。另外，細胞還表達角質(zhì)蛋白6(K6)，后者一般表達在表皮傷口愈合中激活的角質(zhì)上皮細胞。我們認為這

8、些來自皮膚外植體的表皮細胞是以一種模擬表皮細胞對創(chuàng)傷的反應方式主動遷移游出外植體的。相比于傳統(tǒng)分離方法被動獲得的細胞，前者因此具有更加強大的生長潛力。令人意想不到的是，當這些完成角質(zhì)上皮細胞原代培養(yǎng)的皮膚外植體被回收利用，重新添加新鮮的培養(yǎng)液后，可以重復產(chǎn)生外生性角質(zhì)細胞生長層，而可持續(xù)提供角質(zhì)上皮細胞用于原代培養(yǎng)。這一發(fā)現(xiàn)使從少量的皮膚組織獲取更多的角質(zhì)上皮細胞以供臨床應用成為可能。
　　 第二章:
　　 皮膚創(chuàng)傷后，

9、即刻產(chǎn)生內(nèi)生性電流。已經(jīng)證明，這一內(nèi)生性電流可以指導表皮細胞的方向性運動遷移，而在表皮創(chuàng)傷愈合中扮演重要的角色。如前所述，創(chuàng)傷愈合過程中成纖維細胞的運動遷移至關重要。不過，這種內(nèi)生性電流是否影響成纖維細胞的運動遷移，目前還不清楚。在這里，我們發(fā)現(xiàn)并證明小鼠的皮膚創(chuàng)傷后產(chǎn)生內(nèi)生性電流，這一電流持續(xù)數(shù)小時至數(shù)天。我們繼而應用不同強度的電場作用于培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞，包括原代培養(yǎng)細胞和細胞株以觀察細胞對電場作用的反應。在強度為50-100mV

10、/mm的電場中，兩種來源的人真皮成纖維細胞都顯示出向電場正極方向的方向性運動趨勢，不過與無外加電場的對照組細胞相比，細胞的運動速度相對減慢。這和表皮細胞對電場的反應形成鮮明對比，后者向電場的負極方向呈加速運動。不同于表皮細胞，真皮成纖維細胞在電場中向正極方向的方向性運動，至少要經(jīng)過一個小時的時間才顯示出來。
　　 我們之前的研究展示了電場通過激活Phosphatidylinositol-3-OH激酶(PI3-K;PI3激酶)信號

11、傳導通路而引起表皮細胞的向電極負極方向的趨電性運動，在當前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)在給電10分鐘內(nèi)成纖維細胞的磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)水平就有明顯的增高，最大程度的激酶激活狀態(tài)的高峰表現(xiàn)在給電60分鐘時，并在實驗全程的5個小時之內(nèi)都保持在這種較高水平。而在PI3-激酶催化亞基，p110g基因敲除的小鼠，這種變化并不明顯。我們的研究顯示人真皮成纖維細胞在電場作用下出現(xiàn)的向正極方向的方向性趨電運動是由電場的強度和作用時間決定的劑量和時間依賴

12、性運動。生理強度(100mV/mm)的電場需要作用長于1小時的時間才可顯示出可觀測到的細胞趨電性運動。研究同時顯示，和表皮細胞相類似，在人真皮成纖維細胞對電場作用的趨電性反應中，PI3-激酶扮演重要角色。外加電場激活真皮成纖維細胞內(nèi)的PI3-激酶信號，而明顯增高磷酸化Akt的水平。這些結果建議，生理性電場可以引導真皮成纖維細胞的趨電性運動，而這種趨電性運動很可能是由PI3-激酶信號傳導通路以與同表皮細胞相類似的方式介導的。
　　

13、 盡管早在150年前，人們就已經(jīng)知道創(chuàng)傷可以產(chǎn)生電流，但是電流在創(chuàng)傷愈合中的作用卻一直被忽略不計，更沒有報道在基因水平上研究證實細胞對電流的反應。我們的研究首次證明人體真皮成纖維細胞在外加的生理性電場中產(chǎn)生趨電性的定向運動，并率先在基因水平提出成纖維細胞的這種趨電性是由PI3激酶信號傳導通路介導的理論。在當前研究的基礎上，我們期待能在未來為臨床的創(chuàng)傷愈合提供一個新的療法，即應用小劑量的電場，模擬并且加強傷口的內(nèi)生性生理電場，刺激皮膚成纖

14、維細胞運動，加速向傷口區(qū)域聚集，從而加速傷口愈合。
　　 第三章:
　　 這里介紹了建立一個在體的人體皮膚創(chuàng)傷愈合模型的初步研究。當前對創(chuàng)傷愈合研究的一個主要分支就是對人工皮膚替代品的研制開發(fā)。目前的研究趨勢是將活性真皮成纖維細胞和/或表皮細胞與真皮代用品相結合來制備組織工程人皮膚替代物。然而，還沒有一個理想的測試模型，可以更加準確真實地模擬人體的皮膚創(chuàng)傷愈合環(huán)境，以檢驗皮膚替代產(chǎn)品的臨床功效。同時，也需要有一種能夠向創(chuàng)

15、傷中輸送細胞的載體系統(tǒng)，以檢測不同細胞以及細胞組合在創(chuàng)傷中的協(xié)同作用。當前實驗的目的就是試圖要建立這樣一個體外的活體皮膚創(chuàng)傷模型，能最大限度地反映人體的在體皮膚創(chuàng)傷愈合過程，并且可以通過應用細胞載體系統(tǒng)來檢驗組織工程皮膚代用品和不同類型細胞對傷口愈合的影響，最終決定應用細胞療法治療傷口愈合的理想治療方案。本實驗中，我們將臨床手術后病人的剩余皮膚事先移植到裸鼠背部皮膚缺損上，移植的全厚皮片在7天左右成活，2個月左右成熟至接近在體的皮膚形態(tài)

16、結構。然后在成熟的移植人皮膚皮片上鉆孔，創(chuàng)建一個全厚的人體皮膚的創(chuàng)傷模型。與此同時將培養(yǎng)的細胞直接接種培養(yǎng)在Integra上，應用Intergra作為細胞載體，將真皮細胞移植到傷口中，可以測試不同類型細胞對傷口愈合的影響。我們在實驗中觀察到了重新上皮化，真皮結構重建，基底膜重新形成等這些在體的皮膚創(chuàng)傷愈合過程特征可以在填充了真皮代用品的裸鼠人體皮膚傷口愈合模型上真實重現(xiàn)。我們這里介紹的短期研究率先應用移植的人體皮膚建立了體外皮膚創(chuàng)傷模型