食管癌引流淋巴結(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)及體內(nèi)抑瘤試驗.pdf

1、目的：腫瘤引流淋巴結(jié)(Tumor-draininglymphnode，TDLN)是位于腫瘤引流區(qū)的淋巴結(jié)，它長期接受腫瘤抗原的刺激，既是早期腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的暫時的天然屏障，又是腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的中繼站。TDLN含有豐富的淋巴細(xì)胞，由于其特殊的位置，又含有較多的已攝取腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞(Dendriticcell，DC)，是一種較好獲得的對腫瘤細(xì)胞有很強殺傷作用淋巴細(xì)胞的潛在來源。DC是體內(nèi)功能最為強大的專職抗原遞呈細(xì)胞(Antigenp

2、resentingcell，APC)。在捕獲腫瘤抗原后，DC遷移至TDLN，發(fā)育成熟并遞呈抗原，誘導(dǎo)T細(xì)胞分化、成熟，殺傷腫瘤細(xì)胞。但是在患者體內(nèi)，DC往往受到IL-10等抑制因子的作用不能有效地遞呈抗原。本實驗采取體外培養(yǎng)食管癌引流區(qū)淋巴結(jié)細(xì)胞的方法，減少抑制因子的作用，使DC有效地遞呈抗原，得到大量對腫瘤有特異性殺傷作用的細(xì)胞，再回輸同體食管癌裸鼠移植瘤模型，研究食管癌腫瘤引流區(qū)淋巴結(jié)細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)對腫瘤細(xì)胞的生長抑制和殺傷作用。

3、 方法：手術(shù)時摘除食管癌引流區(qū)肉眼判斷無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)2-3枚。同時從食管外側(cè)切開食管壁，避開纖維組織豐富處，無菌切除癌組織一塊。將淋巴結(jié)用D-Hank's液沖洗兩遍，去除結(jié)締組織和脂肪組織，用剪刀剪碎，懸于30毫升含IL-2175U/ml，IL-4500U/ml，GM-CSF100U/ml的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。定期觀察形態(tài)學(xué)變化，收集部分細(xì)胞進(jìn)行檢測和流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)

4、CM)分析。將切下的食管癌瘤塊用D-Hank's液沖洗兩遍，切成約1mm3大小接種到24只3—4周齡BALB/C裸鼠腋背部皮下建立人食管癌裸鼠移植瘤模型。1周后將裸鼠隨機分成共4組，每組6只。依次將生理鹽水0.2ml；IL-21000U/ml0.2ml；LAK細(xì)胞2×107/ml0.2ml，IL-21000U/ml0.2ml：TDLN細(xì)胞2×107/ml0.2ml，IL-21000U/ml0.2ml局部注射4組裸鼠體內(nèi)。每只裸鼠3天局部

5、注射IL-21000U/ml0.2ml一次，測量記錄腫瘤的最長直徑(a)和最短直徑(b)，按體積(V)=πab2/6計算腫瘤體積，分別采用GeneralLinearModel和One-wayANOVA進(jìn)行統(tǒng)計，分析移植瘤生長抑制情況。5周后處死裸鼠取出瘤塊。將瘤塊一分為二，一半檢測凋亡情況，70％的酒精固定，研搓，分別過不銹鋼網(wǎng)和銅網(wǎng)濾去細(xì)胞團(tuán)塊，收集細(xì)胞懸液，離心。取單細(xì)胞懸液1×105/ml0.1ml，加入雞血紅細(xì)胞作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，與

6、樣品同步染色，加入EB(溴化已啶)1ml染色，上機檢測：將另一半腫瘤組織放入福爾馬林溶液中固定、脫水、石蠟包埋切片。常規(guī)HE染色，鏡下觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)和凋亡情況；由有經(jīng)驗的病理醫(yī)師診斷核實，選出部分切片做免疫組化，觀察T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞浸潤情況。 結(jié)果：TDLN細(xì)胞在體外大量增殖，從5-7天開始逐漸形成大量球形細(xì)胞集落，14天-21天達(dá)到高峰期，4周-5周淋巴結(jié)細(xì)胞開始大量死亡。1.0克淋巴組織在體外培養(yǎng)7d、14d、21d

7、可分別獲得1.0×108、1.41×108和1.28×108細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)表型分析顯示TDLN細(xì)胞主要由CD3+T細(xì)胞和CD83+成熟DC組成，進(jìn)一步分析顯示，在CD3+T細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞略多于CD8+T細(xì)胞，還有很少量的CD56+NK細(xì)胞。在TDLN細(xì)胞培養(yǎng)1周后，用流式細(xì)胞儀未檢測出有異倍體細(xì)胞。 本實驗人食管癌裸鼠移植瘤成活率為100％。首先對四種方法采用GeneralLinearModel進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果有顯著性差別

8、(F=18.505，P=0.000)。再分別對每周的4組移植瘤體積進(jìn)行單因素方差分析：第一到五周空白對照組與IL-2組均無顯著性差別；第三、四、五周TDLN細(xì)胞組和第三、四周LAK細(xì)胞組各自與其它三組之間有顯著性差別；第五周LAK細(xì)胞組與IL-2組無顯著性差別，與TDLN細(xì)胞組有顯著性差別。進(jìn)一步計算抑瘤率看到TDLN細(xì)胞組各周的抑瘤率均大于LAK細(xì)胞組；各組第五周的抑瘤率都低于第四周。流式細(xì)胞術(shù)檢測各組移植瘤標(biāo)本的凋亡情況?？瞻讓φ战M

9、和IL-2組均未測到凋亡峰，LAK細(xì)胞組和TDLN細(xì)胞組均有明顯的凋亡峰，TDLN細(xì)胞組的凋亡峰更高。對各組凋亡率采用單因素方差分析，統(tǒng)計顯示IL-2組、LAK細(xì)胞組和TDLN細(xì)胞組這三組之間均有顯著性差別。TDLN細(xì)胞組的凋亡率最高。移植瘤標(biāo)本切片常規(guī)HE染色鏡下可見大小不一、核大深染的腫瘤細(xì)胞。LAK細(xì)胞組和TDLN細(xì)胞組免疫組化可見被染成棕黃色的淋巴細(xì)胞浸潤在腫瘤組織中，后者的數(shù)量明顯多于前者。 結(jié)論：1腫瘤引流淋巴結(jié)細(xì)胞

10、可以在體外大量增殖，其生長期一般為4—5周；它主要含有T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，同時還含有少量NK細(xì)胞等。 2小劑量的IL-2和IL-4、GM-CSF可以刺激淋巴細(xì)胞和DC大量增殖活化。 3TDLN細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞具有比LAK細(xì)胞更強的殺傷作用和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能。 4腫瘤引流淋巴結(jié)中含有豐富的淋巴細(xì)胞和受腫瘤致敏的樹突狀細(xì)胞，且TDLN容易獲得，是一種很好的能獲得對腫瘤細(xì)胞有很強殺傷作用細(xì)胞的潛在來源。 總