小鼠脂肪組織成纖維細(xì)胞系的建立以及C-EBPα，PPARγ和Pref-1原核表達(dá)，多克隆抗體制備.pdf

1、通過建立內(nèi)臟脂肪組織成纖維細(xì)胞系(visceraladiposefibroblastcellline，VAFC)以及對其基因表達(dá)特征和功能的研究，探討脂肪組織成纖維細(xì)胞在肥胖相關(guān)慢性炎癥中的作用；通過表達(dá)Pref-1-GST融合蛋白及制備C/EBPα，PPARγ多克隆抗體，為探討Pref-1抑制脂肪細(xì)胞分化的作用機(jī)制作準(zhǔn)備。 方法：1通過組織塊培養(yǎng)法分離建立VAFC細(xì)胞系； 2原子力顯微鏡(atomicforcemicr

2、oscope，AFM)和透射電子顯微鏡(transmittionelectronicmicroscope，TEM)分析VAFC細(xì)胞形態(tài)特征，染色體分析分析遺傳特征，RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析基因表達(dá)特征； 3VAFC條件培養(yǎng)基(conditionedmedium，CM)處理骨髓細(xì)胞(bonemarrowcells，BMCs)，6天后通過酵母吞噬實(shí)驗(yàn)，分析VAFCCM對巨噬細(xì)胞發(fā)育的影響； 4在無血清條件下，VAF

3、CCM處理BMCs，24h后用PE-膜聯(lián)蛋白-V(Annexin-V-PE)和7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycinD，7-AAD)雙染色，流式細(xì)胞儀分析VAFCCM對BMCs凋亡的影響； 5分離小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞，以羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,CFDA-SE)染色，加入多克隆刺激劑刀豆蛋白(concanavalin，Con

4、A)進(jìn)行刺激，用VAFCCM處理48h后，流式細(xì)胞儀分析VAFCCM對淋巴細(xì)胞增殖的影響； 6表達(dá)Pref-1-GST融合蛋白及制備CCAAT/enhancerbindingproteina(C/EBPα)，peroxisomeproliferatoractivatedreceptorγ(PPARγ)多克隆抗體。 結(jié)果：1.通過脂肪組織塊培養(yǎng)法建立了VAFC細(xì)胞系，該細(xì)胞系已經(jīng)穩(wěn)定傳代150多代，近兩年。 2.原

5、子力顯微鏡分析顯示細(xì)胞膜表面有大量深淺不一的“凹陷”和許多片狀偽足；透射電子顯微鏡分析顯示在細(xì)胞膜上有凹陷，與凹陷相鄰處有偽足形成的凸起結(jié)構(gòu)，并且其中充滿蛋白質(zhì)顆粒；細(xì)胞為超二倍體核型，染色體數(shù)目為48到76；RT-PCR分析顯示VAFC細(xì)胞表達(dá)成纖維細(xì)胞標(biāo)記基因成纖維細(xì)胞特異蛋白(FSP1)，纖連蛋白(fibronectin)和Ⅰ型膠原，以及一些細(xì)胞因子如TNFa，IL-6，adiponectin，resistin，ASP，MIF，M

6、CP-1，agt和IGF-1；免疫熒光染色分析顯示細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原和MCP-1蛋白。 3.VAFCCM有利于骨髓細(xì)胞貼壁，促進(jìn)骨髓細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。在VAFCCM培養(yǎng)條件下，貼壁細(xì)胞比對照顯著增多，分別為2×10細(xì)胞/孔，0.6×10細(xì)胞/孔。在相差顯微鏡下，對照中BMCs為梭狀或多角形；而在VAFCCM處理組，細(xì)胞主要是大而圓的形態(tài)。VAFCCM處理的BMCs，89±1％具有吞噬活性，吞噬指數(shù)為14±2，而在對照組只有47±

7、3％具有吞噬活性，吞噬指數(shù)為6±1。 4.與對照相比，VAFCCM顯著促進(jìn)BMCs在無血清條件下存活，存活率為74.8(±4.10)％對46.7(±4.33)％(P＜0.01)；可以保護(hù)細(xì)胞免受凋亡，凋亡率為19.3(±2.37)％而在對照中凋亡率為32.4(±1.75)％(P＜0.05)。 5VAFCCM干擾ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖。與ConA單獨(dú)刺激相比，VAFCCM與ConA一起處理細(xì)胞降低細(xì)胞增殖程度，增殖比率

8、為44.01(±1.77)％對50.69(±1.21)％(P＜0.01)。 6獲得Pref-1-GST融合蛋白及兔抗鼠C/EBPα，PPARγ多克隆抗體。結(jié)論： 1.建立一株穩(wěn)定的脂肪組織成纖維細(xì)胞系，該細(xì)胞系發(fā)生轉(zhuǎn)化，并且能夠表達(dá)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子。 2.VAFC細(xì)胞在體外促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)育，干擾淋巴細(xì)胞增殖，它是研究脂肪組織成纖維細(xì)胞在肥胖相關(guān)慢性炎癥中的作用的模型。 3.獲得Pref-1-GST融合蛋白