ELMOSs蛋白在乳腺癌趨化運動及轉移中的機制研究.pdf

1、背景和目的:
　　 乳腺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在我國居女性惡性腫瘤的第一位，嚴重威脅著人們的生命健康。近些年來，由于對乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)，以及綜合治療手段的不斷提高，其死亡率呈逐年下降趨勢。然而伴有遠處轉移或復發(fā)患者的預后仍然很差。腫瘤轉移由于治療效果差，已經(jīng)成為致患者死亡的主要原因。
　　 我們的研究試圖通過對乳腺癌細胞的趨化運動機制的探索來了解ELMO是如何調控乳腺癌細胞的遷移。趨化因子CXCL12及其G-蛋

2、白偶聯(lián)受體CXCR4能夠介導乳腺癌細胞的遷移，侵襲和轉移。但是，目前趨化因子和G蛋白偶聯(lián)受體信號通路對于肌動蛋白聚合和腫瘤細胞趨化運動的通路尚不明確。尤其是趨化因子-G蛋白偶聯(lián)受體-Rac的激活-肌動蛋白聚合/ELMO蛋白，在腫瘤趨化運動和轉移中是以何種機制來發(fā)揮作用的將是我們的研究重點。從而更進一步深入了解乳腺癌細胞的趨化運動和轉移機制，為乳腺癌的診斷和治療提供可靠的分子基礎。
　　 方法:
　　 1)應用Wester

3、n Blot的方法檢測不同乳腺細胞中的ELMOs蛋白表達水平。
　　 2)應用Wound healing Assay、Chemotaxis Assay、Invasion Assay、F-actinPolymerization Assay檢測ELMO1蛋白降表達后，對于乳腺癌細胞遷移和趨化運動的影響。
　　 3)應用MTT方法檢測ELMO1是否對于乳腺癌細胞增殖有影響。
　　 4)應用質譜學分析方法，以求找到與EL

4、MO1相互作用的重要蛋白，并應用Co-IP的實驗技術進一步驗證。
　　 5)利用免疫熒光共聚焦的實驗技術和細胞成分分離的方法檢測ELMO1在細胞中的定位以及與Gai2共定位的現(xiàn)象。
　　 6)建立ELMO1降表達穩(wěn)定細胞系，腫瘤原位接種到小鼠脂肪墊上，構建肺轉移模型，探討ELMO1降表達在小鼠體內(nèi)轉移的影響。
　　 7)免疫組化方法檢測ELMO1在人乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達，分析ELMO1的表達水平與腫瘤

5、轉移等臨床病理參數(shù)的相關性。
　　 結果:
　　 1)ELMO1可以促進乳腺癌細胞遷移、趨化運動和侵襲的能力。
　　 我們首先觀察了ELMOs蛋白在MDA-MB-231，BT549，ZR-75-30，MCF-7，T47D，BCAP-37，SKBR3，MCF10A和HBL100的9種人乳腺細胞表達水平，ELMO1和ELMO2均有不同程度的表達。并且在較高轉移性的乳腺癌細胞諸如MDA-MB-231和BT549中高表達

6、。
　　 為了研究ELMOs蛋白對人乳腺癌細胞的遷移能力影響，我們在人乳腺癌細胞MDA-MB-231和其他兩個乳腺癌細胞株T47D和MCF-7采用基因沉默技術抑制ELMO1的表達，然后運用體外transwell實驗技術檢測。我們發(fā)現(xiàn)，趨化因子CXCL12對MDA-MB-231，T47D和MCF-7細胞有明顯誘導的趨化作用，而基因沉默ELMO1則抑制CXCL12誘導的趨化作用。另外檢測表明基因沉默ELMO1的細胞株表現(xiàn)為遷移能力降

7、低。為了檢測CXCL12介導的MDA-MB-231細胞的侵襲能力，我們使用了體外基質膠侵襲實驗技術。MDA-MB-231細胞（正常和對照組）表現(xiàn)出明顯的侵襲能力，而siELMO1細胞株則侵襲功能受到抑制。百日咳毒素(PTX)是Gai信號通路的特異性抑制劑，使用百日咳毒素(PTX)處理細胞后發(fā)現(xiàn)CXCL12所介導的腫瘤細胞的趨化作用和遷移能力進一步受到抑制。在siELMO1沉默表達的細胞中肌動蛋白的聚合水平則是下調的，這種下調作用在PTX

8、作用下更為明顯。我們還利用了MTT的檢測方法研究ELMO1對乳腺癌細胞的增殖作用，結果表明siELMO1細胞沒有表現(xiàn)出對細胞增殖明顯的抑制作用。
　　 2)通過質譜分析鑒定出與ELMO1相互作用的蛋白質。同時，ELMO1的N末端與Gai2亞基相互結合。CXCL12的刺激可以促進Gai2與ELMO1蛋白N末端的結合，并且Gai2-ELMO1/DOCK180途徑在趨化因子受體所介導的乳腺癌細胞遷移、趨化運動和轉移中發(fā)揮重要作用。

9、r>　　 3)CXCL12誘導ELMO1跨膜移位。
　　 趨化因子刺激前，Gai2比ELMO1更加明顯定位在細胞膜上，在CXCL12刺激的情況下，ELMO1顯著地轉運到細胞膜上并與Gai2共定位（相互結合）。相反，在Gai2基因沉默的細胞中無論是否受到CXCL12的刺激，ELMO1轉運到細胞膜的能力被抑制。上述結果表明，CXCR4趨化受體的激活可以誘導依賴于Gai2的ELMO1蛋白跨膜運動。
　　 4)CXCL12誘導

10、Rac的激活和跨膜。CXCL12所誘導的Rac1和Rac2的激活作用可以通過阻斷Gai通路（PTX處理細胞）或者ELMO1基因沉默而被抑制。趨化因子CXCL12可以激活Gai通路并引發(fā)ELMO1/DOCK180復合體激活Rac1和Rac2。
　　 5) ELMO1對于PDK1/AKT和ERK1/2的激活是非必須的。
　　 利用生化檢測方法我們發(fā)現(xiàn)CXCL12誘導的PDK1和AKT的膜轉運在siELMO1細胞和對照組乳腺癌

11、細胞中都有發(fā)生。另外，在siELMO1和對照組細胞中，PDK1和AKT的磷酸化水平并無明顯變化，而且在CXCL12誘導下，ERK1/2的激活也未觀察到明顯的改變。因此，無論是PDK1/AKT還是ERK1/2的激活通路，均不依賴于ELMO1。
　　 6) ELMO2在乳腺癌趨化運動中也發(fā)揮著相似的功能，調控乳腺癌細胞的趨化運動。ELMO2-YFP也可以免疫共沉淀DOCK180，Gai2, Rac1和Rac2。CXCL12的誘導可以

12、激活Rac1和Rac2，但在PTX處理抑制了Gai通路或者siELMO2細胞中則不能激活Rac1和Rac2，同時CXCL12誘導的肌動蛋白聚合能力和趨化運動在siELMO2細胞中受到抑制。研究結果表明，ELMO1和ELMO2在CXCL12誘導的乳腺癌細胞MDA-MB-231趨化運動中發(fā)揮著相似的功能。
　　 7)在活體內(nèi)，ELMO1對于乳腺癌的轉移同樣起著重要的作用。我們首先檢測了ELMO1和ELMO2乳腺組織中的表達情況。EL

13、MO1/ELMO2在乳腺癌的組織中高表達。此外，ELMO1的表達水平還與乳腺癌的轉移息息相關。
　　 我們還在SCID小鼠體內(nèi)檢測了ELMO1與乳腺癌轉移的關系，建立了乳腺癌肺轉移模型。研究結果表明ELMO1盡管在腫瘤生長過程中是非必要的，但是其在腫瘤體內(nèi)轉移的過程中起著重要的作用。
　　 結論:
　　 1)ELMO1可以促進乳腺癌細胞遷移、趨化運動和侵襲的能力。
　　 2)通過質譜分析鑒定出與ELMO1