過表達Derlin-1對香煙煙霧提取物誘導Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡的作用研究.pdf

1、目的：觀察過表達Derlin-1的RLE-6TN細胞經香煙煙霧提取物（cigarette smoke extrac，CSE）不同時間處理后的凋亡率的變化。探索其與內質網應激誘導性凋亡(Endoplasmic reticulum stress induced apoptosis,ERSIA)的關系。
　　方法：攜帶Derlin-1編碼序列的慢病毒轉染RLE-6TN細胞過表達Derlin-1基因；轉染空白慢病毒作為對照組；制備CSE;

2、用10％CSE處理對照組、過表達組細胞0h、3h、6h、12h、24h;流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率；Western blot技術檢測各組細胞Derlin-1、IRE1、p-IRE1、JNK、P-JNK,CHOP、caspase12蛋白的表達;Realtime-PCR技術檢測各組細胞Derlin-1mRNA的表達。
　　結果：
　　1.慢病毒過表達Derlin-1穩(wěn)定株的檢測：Western blot檢測過表達組Derli

3、n-1蛋白的表達較對照組增加，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。Realtime-PCR檢測Derlin-1mRNA的表達結果與Western blot結果一致。
　　2.流式細胞技術檢測細胞凋亡：用10%CSE處理對照組、過表達組細胞0h,3h,6h,12h,24h后收集細胞，用Annexin V-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒處理后在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。對照組及過表達組凋亡率隨著處理時間延長而增加，每組各時間點之

4、間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。過表達組凋亡率較對照組均明顯降低，同一時間點的兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　3.Derlin-1在各組細胞中的表達：Western blot結果顯示對照組Derlin-1的表達隨CSE處理時間的延長呈逐漸增加的趨勢，且組與組之間差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。在過表達組，Derlin-1的表達同樣呈現(xiàn)出隨時間延長的增長趨勢，各組間的兩兩比較均有統(tǒng)計學差異（p<0

5、.05）。但每組較對照組表達量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。Realtime-PCR檢測兩組Derlin-1mRNA的表達結果與Western blot結果一致。
　　4.Derlin-1對ERS通路的影響：Western blot結果顯示在對照組及過表達組中總的IRE1的表達在各時間點的變化不大，差異沒有統(tǒng)計學意義（p>0.05）。兩組的p-IRE1均有隨處理時間的延長呈現(xiàn)增加趨勢，每組各時間點的比較具有統(tǒng)計學意

6、義（p<0.05)。但過表達組的p-IRE1的表達量較對照組有所下降，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）
　　5.Derlin-1對ERSIA通路的影響：Western blot結果顯示在對照組和過表達組中總JNK的表達量在各時間點的表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。p-JNK與CHOP的表達量在兩組中均有逐漸增加的趨勢，呈時間依賴性，每組各時間點兩兩比較差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。兩種蛋白過表達組較對照組

7、表達量均下降，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。caspase12的表達量在對照組從3h升高，12h達高峰，24h有所下降，但仍高于0h組，各時間點的兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。在過表達組中，caspase12的表達隨時間的延長而增加，但各時間點表達量較對照組均下降，且差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　結論：CSE誘導RLE-6TN細胞發(fā)生ERS，促進ERSIA的發(fā)生。Derlin-1的上調可以緩解ERS,保