糖尿病心臟缺血-再灌注損傷與保護(hù)的新機(jī)制-S1P1-3介導(dǎo)的心臟微血管損傷調(diào)節(jié).pdf

1、【研究背景】
　　截止到2010年，英國、美國、中國大陸以及阿拉伯國家的糖尿?。―iabetesmellitus,DM）患病率分別已經(jīng)達(dá)到7％、11％、15％、和17％。而75％-80％的糖尿病患者死于心血管意外，提示心血管并發(fā)癥是糖尿病患者的“頭號殺手”。隨著對動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的深入理解及血管再通治療的廣泛開展，糖尿病冠狀動脈大血管病變的治療已取得階段性進(jìn)展，但令人意外的是，糖尿病患者心血管意外的發(fā)生及死亡率仍居高不下。

2、r>　　目前國際公認(rèn)心臟微循環(huán)功能障礙是糖尿病缺血性心臟病結(jié)構(gòu)、功能損害的重要表現(xiàn)和因素之一。大量研究證明，以VEGF及其受體為代表的血管生成相關(guān)因子具有同時促進(jìn)通透性上調(diào)和血管新生的功能，但無法全面解釋糖尿病缺血性心臟病微血管病變的發(fā)生發(fā)展過程。而筆者在攻讀碩士期間的研究結(jié)果(碩士畢業(yè)論文題目“早期糖尿病大鼠心肌微血管的病理變化及與VEGF和PKC-β的關(guān)系”)也同樣提示在調(diào)控糖尿病心臟微血管病變的病理生理過程中，仍有未明確的因素與機(jī)

3、制。
　　S1P是一種具有生物活性的鞘酯類物質(zhì)，已有研究證明血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)其受體亞型S1P1和S1P3不僅參與體內(nèi)VEGF調(diào)控的多種病理生理過程，而且具有獨(dú)立于VEGF之外的血管調(diào)節(jié)作用，強(qiáng)烈提示其參與糖尿病心臟微血管病理生理調(diào)節(jié)的可能性。但是，S1P1/3相關(guān)的下游分子錯綜復(fù)雜(Erk，Rac，PKC等)，具體是哪些分子可能參與介導(dǎo)調(diào)控糖尿病心臟微血管損傷仍然未知。而PKC家族作為細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典信號通路上的關(guān)鍵分子，介導(dǎo)多種包括心

4、臟保護(hù)在內(nèi)的病理生理過程。而筆者碩士期間的研究基礎(chǔ)也證明其亞型PKCβⅡ在糖尿病缺血性心臟病微血管損傷與保護(hù)中發(fā)揮著重要的作用。那么，是否PKCβⅡ就是介導(dǎo)S1P1/3調(diào)控心臟微血管病理生理功能，進(jìn)而影響糖尿病缺血性心臟病的關(guān)鍵分子，也有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　【研究目的】
　　1.明確S1P1/3在糖尿病心臟微血管損傷調(diào)節(jié)中的重要作用和相關(guān)機(jī)制，并闡明S1P受體激動劑FTY720對糖尿病心臟微血管的保護(hù)作用；
　　2.

5、明確S1P1/3在糖尿病心臟微血管缺血/再灌注損傷中的重要作用和相關(guān)機(jī)制，并闡明S1P受體激動劑FTY720后處理對心臟微血管缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　【研究方案】
　　1.實(shí)驗(yàn)1（基于研究目的1）：
　　1.1動物實(shí)驗(yàn)部分(每組10只)
　　1)STZ(50mg/kg)一次性腹腔注射制備糖尿病大鼠模型，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組需要，在病程4w時每天給予或不給予一次FTY720(1mg/kg)腹腔注射進(jìn)行干預(yù)，所有

6、動物在病程8w時取用；
　　2)動物實(shí)驗(yàn)分組：正常組(Con)，糖尿病組(DM)，空載干預(yù)組(DM+Ve)，F(xiàn)TY720治療組(DM+FTY720)；
　　3)通過免疫熒光技術(shù)對Tunel/CD31/DAPI進(jìn)行多重標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡下觀察心臟組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量和凋亡情況；
　　4)通過血管鑄型技術(shù)，掃描電鏡下觀察心臟微血管生成情況；
　　5)利用硝酸鑭作為示蹤劑，透射電鏡下觀察心臟微血管屏障功能；

7、r>　　6)通過免疫熒光技術(shù)對不同分組大鼠心臟組織中S1P1、S1P3的表達(dá)水平進(jìn)行初步觀察
　　7)借助激光捕獲顯微切割系統(tǒng)，采取心臟微血管樣品，用于下一步分子生物學(xué)檢測；
　　8)通過RT-PCR檢測心臟微血管組織中S1P1、S1P3和PKCβⅡ的mRNA表達(dá)水平。
　　1.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分（所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次）
　　1)培養(yǎng)并鑒定大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，根據(jù)分組需要給予正?；蚋咛桥囵B(yǎng)(25mm/L)，同樣根據(jù)分

8、組需要給予或不給予FTY720干預(yù)(10nmol/L)和PKCβⅡ過表達(dá)；
　　2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：正常培養(yǎng)組(Con)，高糖培養(yǎng)組(HG)，空載干預(yù)組(HG+Ve)，F(xiàn)TY720治療組(HG+FTY720)，PKCβⅡ過表達(dá)組(HG+FTY720+PKCβⅡ)；
　　3)采用Tunel/DAPI免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，對心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測分析；
　　4)通過Transwell小室對細(xì)胞遷移進(jìn)行檢測；
　

9、　5)通過Invitrovascularpermeabilityassaykit進(jìn)行單層心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性檢測；
　　6)通過SubcellularProteinFractionationKitforCulturedCells對細(xì)胞核與細(xì)胞膜進(jìn)行分離，用于下一步分子生物學(xué)檢測；
　　7)通過Westernblot檢測心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中S1P1、S1P3和PKCβⅡ的蛋白表達(dá)情況。
　　2.實(shí)驗(yàn)2（基于研究目的2

10、）：
　　2.1動物實(shí)驗(yàn)部分(每組10只)
　　1)STZ(50mg/kg)一次性腹腔注射制備糖尿病大鼠模型，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組需要，在病程8w時給予或不給予心臟缺血/再灌注手術(shù)(30min/3h)；同樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，在再灌注前10分鐘給予或不給予FTY720(1mg/kg)，再灌注3小時后采取所需動物標(biāo)本；
　　2)動物實(shí)驗(yàn)分組：糖尿病組(DM)，糖尿病+假手術(shù)組(DM+Sham)，糖尿病+缺血/再灌注手術(shù)組(DM+I/

11、R)，空載干預(yù)組(DM+I/R+Ve)，F(xiàn)TY720治療組(DM+I/R+FTY720)；
　　3)通過大鼠模型右側(cè)頸動脈實(shí)施逆行插管至左心室,實(shí)時記錄血流動力學(xué)參數(shù)并分析；
　　4)通過免疫熒光技術(shù)對Tunel/CD31/DAPI進(jìn)行多重標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡下觀察心臟組織中內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量和凋亡情況；
　　5)利用硝酸鑭作為示蹤劑，透射電鏡下觀察心臟微血管屏障功能；
　　6)通過硫黃素S(Thioflavin-

12、S)/伊文氏藍(lán)雙重染色評估心臟微血管閉塞情況
　　7)借助激光捕獲顯微切割系統(tǒng)，采取心臟微血管樣品，用于分子生物學(xué)檢測；
　　8)通過RT-PCR檢測心臟微血管組織中S1P1、S1P3和PKCβⅡ的mRNA表達(dá)情況。
　　2.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分（所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次）
　　1)高糖培養(yǎng)基(25mm/L)培養(yǎng)大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，根據(jù)分組需要給予或不給予和PKCβⅡ過表達(dá)；同樣根據(jù)分組需要進(jìn)行或不進(jìn)行模擬缺血/再灌注(3

13、0min/3h)處理，以及在再灌注前給予或不給予FTY720干預(yù)(10nmol/L)；
　　2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：高糖培養(yǎng)組(HG)，高糖+模擬假手術(shù)組(HG+Sham)，高糖+模擬缺血/再灌注組(HG+SI/R)空載干預(yù)組(HG+SI/R+Ve)，F(xiàn)TY720治療組(HG+SI/R+FTY720)，PKCβⅡ過表達(dá)組(HG+SI/R+FTY720+PKCβⅡ)；
　　3)采用Tunel/DAPI免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，對心臟微血管內(nèi)

14、皮細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測分析；
　　4)通過Invitrovascularpermeabilityassaykit進(jìn)行單層心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性檢測；
　　5)通過SubcellularProteinFractionationKitforCulturedCells對細(xì)胞核與細(xì)胞膜進(jìn)行分離，用于下一步分子生物學(xué)檢測；
　　6)通過Westernblot檢測心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中S1P1、S1P3和PKCβⅡ的蛋白表達(dá)情況。

15、
　　【研究結(jié)果】
　　1.實(shí)驗(yàn)1（基于研究方案1）：
　　1.1動物實(shí)驗(yàn)部分：
　　1)以多次隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L作為糖尿病模型成功的標(biāo)志，本實(shí)驗(yàn)糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功率在90％以上；
　　2)Tunel/CD31/DAPI多重標(biāo)記的免疫熒光結(jié)果顯示，糖尿病心臟組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少，但是凋亡指數(shù)顯著增高；而FTY720可以明顯減少凋亡；
　　3)血管鑄型結(jié)合掃描電鏡的結(jié)果顯示，糖尿病

16、心臟組織中出現(xiàn)數(shù)目繁多排列紊亂的心臟微血管；FTY720可以明顯緩解上述病理性血管新生的情況；
　　4)硝酸鑭結(jié)合透射電鏡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病會導(dǎo)致心臟微血管通透性上升，屏障功能減弱；FTY720可以改善上述病理現(xiàn)象；
　　5)免疫熒光結(jié)果初步顯示與正常大鼠相比，糖尿病大鼠心臟組織中S1P1表達(dá)下降，S1P3表達(dá)上升；FTY720干預(yù)可以上調(diào)S1P1并下調(diào)S1P3的表達(dá)；
　　6)RT-PCR結(jié)果顯示與正常組相比，糖

17、尿病心臟微血管中S1P1表達(dá)下降，S1P3和PKCβⅡ表達(dá)增高；FTY720干預(yù)可以上調(diào)S1P1并下調(diào)S1P3和PKCβⅡ的表達(dá)水平。
　　1.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分
　　1)低密度乙酰脂蛋白熒光染色的陽性結(jié)果可以確認(rèn)本實(shí)驗(yàn)大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)成功；Western結(jié)果同樣可以確定實(shí)驗(yàn)所涉及PKCβⅡ過表達(dá)穩(wěn)定；
　　2)與正常組比較，高糖培養(yǎng)基中心臟微血管細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯上升，F(xiàn)TY720可以顯著減少凋亡，但對于PKCβ

18、Ⅱ過表達(dá)組，F(xiàn)TY720減少細(xì)胞凋亡的作用顯著減弱；
　　3)與正常組相比，高糖培養(yǎng)基中心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力下降，F(xiàn)TY720可以部分恢復(fù)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力下降，但在PKCβⅡ過表達(dá)組中，F(xiàn)TY720的作用顯著減弱；
　　4)高糖培養(yǎng)基中單層心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性明顯高于正常組，F(xiàn)TY720可以緩解高糖誘導(dǎo)通透性上升的趨勢，但PKCβⅡ過表達(dá)組中，上述FTY720緩解通透性上升的作用被顯著抑制；
　　5)

19、Westernblot結(jié)果顯示與正常組相比，高糖誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中S1P1表達(dá)下降，細(xì)胞膜S1P3表達(dá)上升，而細(xì)胞核S1P3表達(dá)減少，同時伴有PKCβⅡ表達(dá)上升；FTY720干預(yù)可以緩解上述變化；但PKCβⅡ過表達(dá)對細(xì)胞中S1P1和S1P3未產(chǎn)生顯著影響。
　　2.實(shí)驗(yàn)2（基于研究方案2）：
　　2.1動物實(shí)驗(yàn)部分：
　　1)與糖尿病組相比，缺血/再灌注損傷會進(jìn)一步減弱大鼠心室收縮/舒張功能；缺血后給予FTY72

20、0可以明顯減少缺血/再灌注引起的心室功能損傷；
　　2)Tunel/CD31/DAPI多重標(biāo)記的免疫熒光結(jié)果顯示，糖尿病+缺血/再灌注手術(shù)組中心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量急劇減少，凋亡指數(shù)顯著增高；FTY720治療組中凋亡明顯減少；
　　3)通過在透射電鏡下對示蹤劑硝酸鑭的觀測，缺血/再灌注會在糖尿病基礎(chǔ)上進(jìn)一步損害心臟微血管的屏障功能，導(dǎo)致通透性上升；FTY720的缺血后干預(yù)可以部分恢復(fù)屏障功能；
　　4)糖尿病+缺血/再灌

21、注手術(shù)組中心臟微血管閉塞面積明顯大于糖尿病組以及假手術(shù)組，F(xiàn)TY720治療組中心臟微血管閉塞面積顯著減少；
　　5)RT-PCR檢測心臟微血管組織中S1P1、S1P3和PKCβⅡ表達(dá)情況顯示，與糖尿病組和糖尿病+假手術(shù)組相比，糖尿病+缺血/再灌注手術(shù)組S1P1表達(dá)下降，S1P3表達(dá)增加，PKCβⅡ表達(dá)增加；FTY720治療可以明顯緩解上述蛋白的表達(dá)變化。
　　2.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分
　　1)Western結(jié)果可以確定實(shí)驗(yàn)所

22、涉及PKCβⅡ過表達(dá)穩(wěn)定；
　　2)Tunel/DAPI免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，與高糖培養(yǎng)組比較，高糖+模擬缺血/再灌注組中心臟微血管細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯上升，F(xiàn)TY720可以顯著減少凋亡，但對于PKCβⅡ過表達(dá)組，F(xiàn)TY720減少細(xì)胞凋亡的作用顯著減弱；
　　3)與高糖培養(yǎng)組相比，模擬缺血/再灌注可以顯著上調(diào)單層心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，而FTY720可以緩解上述誘導(dǎo)通透性上升的趨勢，但PKCβⅡ過表達(dá)組中，F(xiàn)TY720作用被