HAX-1在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單一核細(xì)胞中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、一、研究背景和目的 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種慢性、可累及多器官系統(tǒng)的自身免疫性疾病，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜，嚴(yán)重影響患者，尤其是育齡期女性的身體健康。SLE確切病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明，其主要的免疫學(xué)特征為B淋巴細(xì)胞的多克隆活化，自身反應(yīng)性T細(xì)胞過度活化，機(jī)體產(chǎn)生大量自身抗體，循環(huán)免疫復(fù)合物沉積于組織和器官，導(dǎo)致多器官系統(tǒng)損害。 近年來研究表明，免疫細(xì)胞凋亡障礙在SL

2、E的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著極大作用。由于SLE患者體內(nèi)淋巴細(xì)胞存在著凋亡與抗凋亡因素之間的不平衡，同時在縛胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控下，體內(nèi)凋亡或凋亡相關(guān)性免疫機(jī)制失調(diào)，最終導(dǎo)致SLE的多種臨床表現(xiàn)。一方面，凋亡誘導(dǎo)基因如Fas/FasL的表達(dá)增加或功能異常的sFas表達(dá)增加，淋巴細(xì)胞凋亡加速，導(dǎo)致核小體及胞質(zhì)分子等自身抗原積聚，加上感染等因素的促進(jìn)作用，巨噬細(xì)胞及補(bǔ)體功能下降使其清除受限，凋亡細(xì)胞作為免疫原打破機(jī)體的免疫耐受狀態(tài)，激活自身反應(yīng)淋巴細(xì)

3、胞，產(chǎn)生自身抗體而致病。另一方面，一些細(xì)胞凋亡抑制基因的表達(dá)異常，如bcl-2在活動期SLE患者淋巴細(xì)胞中高表達(dá)，導(dǎo)致活動性SLE患者淋巴細(xì)胞逃脫細(xì)胞凋亡而處于活化增殖狀態(tài)，導(dǎo)致自身反應(yīng)T細(xì)胞及B細(xì)胞壽命延長，自身反應(yīng)T細(xì)胞清除延遲，導(dǎo)致自身免疫異常而致SLE發(fā)生。臨床上，利用糖皮質(zhì)激素通過抑制過度活化的免疫反應(yīng)、誘導(dǎo)異常活化的淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡來治療SLE取得了良好療效，也表明了SLE體內(nèi)淋巴細(xì)胞異常活化狀態(tài)的存在。 然而，目前

4、對于SLE患者淋巴細(xì)胞中凋亡紊亂的研究并不能完全闡明SLE的凋亡異常情況，提示可能同時存在其它未知的因素參與淋巴細(xì)胞凋亡的調(diào)控。因此，進(jìn)一步對SLE患者淋巴細(xì)胞凋亡異常狀態(tài)進(jìn)行研究，進(jìn)一步闡明SLE患者淋巴細(xì)胞活化的自身調(diào)控機(jī)制，才可能找出誘導(dǎo)免疫細(xì)胞進(jìn)入正常凋亡狀態(tài)治療SLE的有效途徑，從而可望從根本上探索控制sLE發(fā)生和發(fā)展的全新策略。 在我們前期的研究中，通過LongSAGE及GLGI技術(shù)建立了活動期SLE患者治療前后T淋

5、巴細(xì)胞的差異表達(dá)基因文庫，發(fā)現(xiàn)抗凋亡基因HAX-1在活動期SLE患者中表達(dá)明顯增高。該基因是近年發(fā)現(xiàn)的一種具有強(qiáng)大抗凋亡作用的蛋白質(zhì)，其抗凋亡的作用機(jī)制尚不清楚。目前HAX-1在SLE中的作用及其與SLE發(fā)病和病情的關(guān)系國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究報道。我們推測HAX-1在sLE患者PBMC中高表達(dá)可能通過其抗凋亡機(jī)制抑制T、B淋巴細(xì)胞凋亡，從而使淋巴細(xì)胞過度活化，加速SLE的發(fā)生發(fā)展。因此，我們擬首先研究HAX-1基因在SLE淋巴細(xì)胞中的表達(dá)

6、，并進(jìn)一步探討其在SLE淋巴細(xì)胞活化異常中的作用。該研究對于深入了解細(xì)胞凋亡在SLE發(fā)病過程中的詳細(xì)作用，對于部分闡明SLE的發(fā)病機(jī)制，并采取有效措施矯正SLE患者體內(nèi)淋巴細(xì)胞的異常活化狀態(tài)，以緩解甚至控制SLE的病情可能具有重要意義。 二、方法與結(jié)果 1．首先通過半定量RT-PCR及Western blot方法檢測HAX-1在活動期SLE患者PBMC中的表達(dá)，并對其進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLE患者PBMC中HAX

7、-1基因在mRNA及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均明顯高于健康對照組(P<0.01)，且表達(dá)水平和SLE疾病活動性呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)分別等于0.572、0.777，P值均小于0.01，有非常顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。表明HAX-1在SLE患者PBMC中高表達(dá)可能通過其抗凋亡作用參與了SLE的疾病發(fā)展過程。 2．為了證實(shí)HAX-1基因的抗凋亡作用，我們構(gòu)建了HAx-1的真核表達(dá)載體pEGFP-C3-HAX-1，用脂質(zhì)體DMRIE-C體外

8、轉(zhuǎn)染人T淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞，并以600 rads電子線照射、去血清培養(yǎng)及10μmol/L地塞米松(DEX)作用于Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡。經(jīng)酶切測序鑒定，表達(dá)載體pEGFP-C3-HAX-1構(gòu)建成功，且轉(zhuǎn)染后HAX-1能夠正常表達(dá)。通過光鏡、透射電鏡以及TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-HAX-1的Jurkat細(xì)胞抗凋亡能力明顯高于未轉(zhuǎn)染組及pEGFP-C3組，差異均具有顯著性意義，P值均小于0.01，表明HAX-1過

9、表達(dá)具有明顯的抗凋亡能力。該結(jié)果為進(jìn)一步進(jìn)行動物體內(nèi)試驗(yàn)，研究抗凋亡基因HAX-1對sLE病情的影響奠定了理論基礎(chǔ)。 3．利用腺病毒載體系統(tǒng)，將HAX-1基因融合到腺病毒載體基因組中，再通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將構(gòu)建好的重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-HAX-1轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，包裝成為具有感染能力的腺病毒AdHAX-1，并對其進(jìn)行了PCR、腺病毒滴度、感染力和安全性等檢測。結(jié)果經(jīng)酶切和測序鑒定，重組腺病毒中HAX-1表達(dá)明顯增高；包

10、裝后的重組腺病毒經(jīng)氯化銫密度梯度離心法純化后滴度達(dá)3.2×10<'9>TCID<,50>/ml，且能促進(jìn)小鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，并且無野生型病毒的存在。表明重組腺病毒AdHAXC-1構(gòu)建和包裝成功，具有較強(qiáng)的感染能力及較高的生物學(xué)安全性，為MRL/lpr狼瘡鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。同時，構(gòu)建了靶向HAX-1基因的shRNA表達(dá)載體pGenesil-HAX-1，經(jīng)酶切及測序分析，并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，證實(shí)載體構(gòu)建成功。通過RT-PCR及West

11、ern blot試驗(yàn)證實(shí)其在HeLa細(xì)胞內(nèi)的能夠有效引發(fā)RNAi效應(yīng)，下調(diào)HAX-1基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究HAX-1對MRL/lpr狼瘡鼠淋巴細(xì)胞的作用奠定了基礎(chǔ)。 4．AdHAX-1經(jīng)腹腔注射MRL/lpr狼瘡鼠后，觀察小鼠白細(xì)胞、尿蛋白、自身抗體的產(chǎn)生、IFN-γ，分泌情況以及腎臟組織免疫復(fù)合物的沉積和腎小球的病理變化。同時分離MRL/lpr狼瘡鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染pGenesil-HAX-1，觀察脾臟淋巴細(xì)胞的增

12、殖及IFN-γ，的分泌變化。結(jié)果表明HAX-1可使MRL/lpr小鼠的尿蛋白以及IgG型dsDNA抗體、ANA、抗組蛋白抗體、CIC明顯升高，且產(chǎn)生IF-γ水平升高，同時腎臟IgG顯著沉積，腎小球病理損害加重，促進(jìn)了狼瘡鼠的病變過程，與PBS組及AdEGFP組相比較，除CIC及抗組蛋白抗體外，差異均具有顯著性意義(P<0.01或P<0.05)；pGenesil-HAX-1則可使淋巴細(xì)胞的增長率明顯降低(P<0.01)，IFN-γ分泌水平

13、明顯下降(P<0.01)。 三、結(jié)論 1．HAX-1在活動期SLE患者PBMC中的表達(dá)明顯高于正常對照者，表達(dá)水平和SLE的病情活動性呈正相關(guān)。 2．HAX-1基因在體內(nèi)外均具有明顯的抗凋亡作用。HAX-1在Jurkat細(xì)胞中過表達(dá)使其能夠?qū)闺娮泳€照射、DEX誘導(dǎo)及去血清培養(yǎng)等誘導(dǎo)凋亡的作用；重組AdHAx-1體內(nèi)轉(zhuǎn)染MRL/lpr小鼠，可使其脾臟淋巴細(xì)胞凋亡減慢，導(dǎo)致SLE病情加重，下調(diào)HAX-1表達(dá)則有助于