潛在影響溶腫瘤腺病毒功能的腫瘤細(xì)胞內(nèi)在基因Darpp-32和PRSS3的功能鑒定及其作用機(jī)制.pdf

1、鑒于中晚期惡性腫瘤常規(guī)治療療效有限而且副作用明顯,用復(fù)制選擇性溶腫瘤病毒進(jìn)行癌癥靶向治療近來已引起人們廣泛的關(guān)注。2005年,刪除E1855K基因的5型腺病毒H101獲得中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)批準(zhǔn)上市,與化療結(jié)合用于人頭頸部惡性腫瘤的臨床治療,成為世界上第一個(gè)由官方機(jī)構(gòu)正式批準(zhǔn)的復(fù)制選擇性溶腫瘤病毒藥物。該病毒與常規(guī)放化療相結(jié)合顯示出非常令人鼓舞的效果,但是作為單一制劑卻療效甚微。因此,從臨床實(shí)踐上急需研究哪些因素影響溶

2、腫瘤腺病毒的潛能,從而為提高其療效尋找新的策略。
　　 溶腫瘤腺病毒抗腫瘤效果取決于腫瘤細(xì)胞、病毒和機(jī)體對(duì)病毒免疫反應(yīng)之間的相互作用。腫瘤發(fā)生過程中細(xì)胞內(nèi)基因的變化可以導(dǎo)致細(xì)胞表面黏附分子和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變,從而影響腺病毒感染腫瘤細(xì)胞的能力以及病毒在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力。不同組織來源、不同類型的腫瘤細(xì)胞對(duì)復(fù)制選擇性溶腫瘤腺病毒(replication-selective oncolytic adenovirus,RSOA

3、)的敏感性差異顯著,充分說明腫瘤細(xì)胞內(nèi)在基因的變化對(duì)RSOA的潛能有重要影響,目前該方面的研究國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。通過對(duì)一系列腫瘤細(xì)胞對(duì)腺病毒敏感性的篩選,我們先前發(fā)現(xiàn)了一個(gè)很好的細(xì)胞模型:PaTu8988s和PaTu8988t。這一對(duì)細(xì)胞來自同一個(gè)腫瘤病人,對(duì)腺病毒的敏感性卻差異顯著。為了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)哪些腫瘤細(xì)胞內(nèi)在基因影響腫瘤細(xì)胞對(duì)腺病毒的敏感性,我們利用Affymetrix array高通量篩選技術(shù)對(duì)腺病毒非常不敏感的PaTu8988s

4、和對(duì)腺病毒非常敏感的PaTu8988t兩株細(xì)胞基因表達(dá)圖譜進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Darpp-32和PRSS3是兩個(gè)潛在的可能影響腺病毒潛能、且尚未報(bào)道的候選基因。為了研究這兩個(gè)基因與腫瘤細(xì)胞對(duì)溶腫瘤腺病毒敏感性的關(guān)系,本課題從高表達(dá)候選基因及關(guān)閉候選基因兩方面對(duì)其進(jìn)行功能鑒定,并進(jìn)一步研究其作用的分子機(jī)制。該研究結(jié)果為設(shè)計(jì)增強(qiáng)RSOA殺傷腫瘤細(xì)胞能力的新方法提供了科學(xué)理論依據(jù)和方向。本研究分以下兩個(gè)部分。
　　 第一部分 t-Da

5、rpp多磷酸化位點(diǎn)相互作用調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)腺病毒的敏感性
　　 Darpp-32(dopamine and cAMP regulated phosphoprotein32)是多巴胺和cAMP活化調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白。該基因影響多種生理過程,在神經(jīng)遞質(zhì)受體、離子通道、離子泵以及細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子等眾多磷酸蛋白的磷酸化、生理活性以及耐藥等多方面發(fā)揮著關(guān)鍵的控制作用。近來發(fā)現(xiàn)該基因亦與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤細(xì)胞對(duì)一些抗腫瘤制劑的反應(yīng)有密

6、切的關(guān)系。但未見任何關(guān)于Darpp-32與病毒感染之間關(guān)系的報(bào)道。
　　 從表型上看,Darpp-32在腫瘤中的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞對(duì)腺病毒的敏感性呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在一系列人胰腺癌及結(jié)直腸癌細(xì)胞系中表達(dá)的是Darpp-32的剪切同位體t-Darpp。通過關(guān)閉t-Darpp和高表達(dá)t-Darpp兩條途徑進(jìn)行功能性鑒定,我們首次發(fā)現(xiàn),在不同的細(xì)胞系中,t-Darpp分別呈現(xiàn)出增強(qiáng)、減弱或者不影響腫瘤細(xì)胞對(duì)溶腫瘤腺病毒的敏感性三種

7、不同的功能。鑒于Darpp-32基因中存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn),并且不同位點(diǎn)磷酸化在功能上相互調(diào)控從而影響其功能。我們推測(cè),t-Darpp的磷酸化狀態(tài)可能是該基因在不同細(xì)胞系中呈現(xiàn)不同功能的原因。為了證實(shí)我們的假說,通過免疫沉淀的方法收集不同細(xì)胞系中產(chǎn)生不同作用的t-Darpp純化蛋白,用質(zhì)譜檢測(cè)它們的磷酸化位點(diǎn)。結(jié)果不僅證實(shí)了我們的假說:t-Darpp在對(duì)腺病毒敏感性不同的腫瘤細(xì)胞中存在不同的磷酸化位點(diǎn),更為重要的是我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)尚未報(bào)道的

8、、新的t-Darpp磷酸化位點(diǎn)。進(jìn)一步功能實(shí)驗(yàn)證實(shí),這些磷酸化位點(diǎn)的相互作用調(diào)控著腫瘤細(xì)胞對(duì)腺病毒的敏感性。此外,我們對(duì)t-Darpp如何影響腺病毒的生命周期的分子作用機(jī)制進(jìn)行逐步研究,發(fā)現(xiàn)t-Darpp影響腺病毒在腫瘤細(xì)胞上的吸附進(jìn)而影響腺病毒入核、DNA復(fù)制等細(xì)胞內(nèi)的后續(xù)過程。本研究結(jié)果提示,t-Darpp多磷酸化位點(diǎn)相互作用調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)腺病毒的敏感性；特殊位點(diǎn)磷酸化的t-Darpp可能是預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)腺病毒基因治療敏感性的生物標(biāo)

9、記物,有望成為提高腺病毒抗腫瘤效果新的治療靶向。更為重要的是,t—Darpp新磷酸化位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提示該基因可能具有其它未知的生物學(xué)功能。
　　 第二部分 PRSS3不影響腫瘤細(xì)胞對(duì)腺病毒的敏感性,但促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移
　　 PRSS3是胰蛋白酶原家族的一員,多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道該基因與細(xì)胞癌變有關(guān)。從PRSS3蛋白表達(dá)的表型上看,該基因與腫瘤細(xì)胞對(duì)溶腫瘤腺病毒的敏感性相關(guān),但是功能鑒定結(jié)果顯示PRSS3并不影響腺病毒對(duì)腫瘤

10、細(xì)胞的殺傷能力。然而在功能性鑒定PRSS3對(duì)腺病毒感染性影響的實(shí)驗(yàn)中,我們觀察到穩(wěn)定表達(dá)PRSS3的PuTa8988t細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)速度明顯比空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞快。由于PaTu8988t和PaTu8988s源自同一個(gè)胰腺癌患者,轉(zhuǎn)移能力卻差異顯著,我們推測(cè)PRSS3可能影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
　　 本研究通過qPCR和Western Blotting檢測(cè)一組人胰腺癌細(xì)胞系中PRSS3的表達(dá)；通過高表達(dá)外源性PRSS3基因觀察該

11、基因?qū)Π┘?xì)胞體外增殖、腫瘤生長(zhǎng)和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響；通過ELISA檢測(cè)細(xì)胞VEGF的表達(dá)及PRSS3調(diào)控VEGF表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)通路；通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制該轉(zhuǎn)移通路的體內(nèi)治療效果；最后,通過免疫組化檢測(cè)PRSS3蛋白在人胰腺癌組織中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),PRSS3在轉(zhuǎn)移的PaTu8988s細(xì)胞中高表達(dá),而在不轉(zhuǎn)移的PaTu8988t細(xì)胞中不表達(dá)。進(jìn)一步研究顯示PRSS3通過PAR-1介導(dǎo)ERK磷酸化導(dǎo)致VEGF在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞

12、的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。MEK1／2抑制劑可以顯著延緩轉(zhuǎn)移的進(jìn)程、延長(zhǎng)荷瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存時(shí)間(P<0.05)。最后,我們分析了PRSS3在人胰腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系。結(jié)果和預(yù)期一樣,PRSS3在正常胰腺腺泡細(xì)胞中表達(dá),在正常導(dǎo)管上皮細(xì)胞中不表達(dá),而在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞癌組織中表達(dá)。在74例胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞癌組織中,30例(40.5％)PRSS3呈陽(yáng)性表達(dá),44例(59.5％)呈陰性表達(dá)。更有意義的是,PRSS3在浸潤(rùn)至血管內(nèi)和淋巴