X線照射原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元后p35、p25的表達(dá)及Cdk5激酶活性變化.pdf

1、近年來，隨著生活節(jié)奏的加快和人口老齡化，惡性腫瘤的患病率在全世界范圍內(nèi)大幅度提高，成為繼心腦血管疾病之后的人類“第二大殺手”，嚴(yán)重危害人類健康。 放射治療是惡性腫瘤的主要治療手段之一，也是部分腫瘤的根治性手段。據(jù)1998年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全身惡性腫瘤控制率為45%，手術(shù)占22%，放療占18%。大約有超過70%的惡性腫瘤患者有過放療的經(jīng)歷。然而，射線在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)又不可避免地造成正常組織的損傷。放射性腦損傷（radiati

2、on brain injury，RBI）是一種由各種放療所致的腦組織放射性反應(yīng)綜合征，是頭頸部惡性腫瘤放射治療后導(dǎo)致的嚴(yán)重遠(yuǎn)期并發(fā)癥之一。隨著腫瘤治療水平的提高及患者生存期的不斷延長(zhǎng)，放射性腦損傷的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量、生存期和預(yù)后，甚至導(dǎo)致患者的死亡。但目前對(duì)放射性腦損傷的發(fā)病機(jī)制仍不明確，臨床上也缺乏有效的治療手段。因此，研究放射性腦損傷，探索新的治療靶點(diǎn)具有重要的意義。 CDK5（Cyclin-depe

3、ndent kinase5）是脯氨酸限定性絲/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶，是細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶（Cyclin-dependent kinase）家族一特殊成員，其底物包括含Lys-Ser-Pro（KSP）樣基序的MAP1b，含KSPXK的tau和KSPXX的神經(jīng)絲蛋白等。與細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶家族其他成員不同的是，CDK5與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)作用無關(guān)。盡管CDK5在大多數(shù)組織中表達(dá)，但是主要在神經(jīng)系統(tǒng)中有活性，CDK5激酶激活主

4、要限于神經(jīng)系統(tǒng)，是因其調(diào)節(jié)亞基p35、p39特異地存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system）中所致。CDK5在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起關(guān)鍵作用，此外，CDK5參與突觸功能、神經(jīng)元的遷移及粘附、藥物成癮性及神經(jīng)退行性變等多種神經(jīng)功能調(diào)控。CDK5單獨(dú)并不起作用，必須與p35、p39等調(diào)節(jié)亞基結(jié)合錨定于膜上，才能發(fā)揮作用。p35的裂解產(chǎn)物p25可能在調(diào)節(jié)CDK5活性中起重要作用，因?yàn)閜25穩(wěn)定性更高，導(dǎo)致持續(xù)激活CDK5

5、，無節(jié)制地磷酸化其適宜底物。研究表明，神經(jīng)元中CDK5-p25過表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。此外，在神經(jīng)元凋亡過程中，CDK5的表達(dá)及活性增加；在幾種不同的模型中，抑制CDK5活性可以有效地減少神經(jīng)元的壞死和凋亡。 由于CDK5活性和膜細(xì)胞骨架、粘附系統(tǒng)相聯(lián)系，故認(rèn)為CDK5在神經(jīng)元內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮作用。通過磷酸化微管相關(guān)蛋白，CDK5可能作用于微管的動(dòng)力學(xué)和軸漿運(yùn)輸。CDK5所致神經(jīng)元細(xì)胞骨架的異常磷酸化可引起神經(jīng)元的功能異常和死亡。

6、所以認(rèn)為p25可以引起CDK5異常激活，導(dǎo)致細(xì)胞骨架崩解和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸障礙，從而引發(fā)神經(jīng)退變。p35裂解成p25可能是一個(gè)包括神經(jīng)突起回縮，微管崩解和細(xì)胞凋亡連鎖性病理反應(yīng)的關(guān)鍵點(diǎn)。但是，CDK5促進(jìn)細(xì)胞死亡的具體機(jī)制仍未明了。 可以肯定的是，CDK5在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及功能中起決定性作用；此外，諸多證據(jù)表明CDK5的過度激活參與神經(jīng)退行性變過程。那么，CDK5異常激活是否參與RBI的發(fā)病過程，這都是值得探討的未知數(shù)?；诖?，

7、我們用X射線30Gy單次照射培養(yǎng)至12天的海馬神經(jīng)元，用Western-blot方法檢測(cè)CDK5的激活蛋白p35、p25的蛋白水平變化，然后進(jìn)行抑制性干預(yù)實(shí)驗(yàn)，從而探討CDK5調(diào)節(jié)異常是否參與RBI的發(fā)病過程。 [目的]研究X線照射培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元后p35、p25的表達(dá)及CDK5激酶活性變化，為放射性腦損傷的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。 [方法] （1）以培養(yǎng)至第12天的大鼠海馬神經(jīng)元為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用30Gy X射線

8、單次對(duì)其進(jìn)行照射。 （2）分別在照射后3.5h、4h、5h、6h共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用Western-blot檢測(cè)CDK5的調(diào)節(jié)亞基p35、p25蛋白水平。 （3）在照射后24h，用DAPI染核方法檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡情況，觀察CDK5抑制劑roscovitine對(duì)海馬神經(jīng)元放射性損傷的作用。 （4）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)根據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。設(shè)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α為0.05。

9、[結(jié)果] （1）Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：p35（35KD）于照射后增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F（4，15）=19.338，P=0.000，N=4）；照射后3.5h組與對(duì)照組比較相比增加1.52倍，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），照射后4h組增加量為對(duì)照組的1.44倍，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。p25（25KD）表達(dá)水平亦于照射后增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F（4，15）=6.617，P=0.003，N=4）

10、；照射后6h組與對(duì)照組相比增加1.63倍，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。p35、p25表達(dá)水平的改變提示在X線照射原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元后，可能存在CDK5活性增加。 （2）凋亡實(shí)驗(yàn)顯示：在照射前15min用CDK5抑制劑roscovitine（10μM）孵育原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，可以部分保護(hù)照射誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元死亡（F（2，13.121）=146.226，P=0.000，N=9）。30Gy組在照射后24h核固縮百分?jǐn)?shù)為（24.

11、8%±3.97%），較0Gy組（1.82%±1.08%）有顯著性差異（P<0.001）；30Gy+roscovitine組在照射后24h核固縮百分?jǐn)?shù)為（7.74%±2.27%），較30Gy組有顯著性差異（P<0.001），亦較0Gy組有顯著性差異（P<0.001）。 [結(jié)論] （1）X線照射培養(yǎng)海馬神經(jīng)元后p35、p25蛋白表達(dá)增加，可能異常激活CDK5； （2）應(yīng)用CDK5抑制劑roscovitine抑制CDK