白介素-1β介導(dǎo)膿毒癥新生大鼠軸突和突觸損傷的機(jī)制研究.pdf

1、新生兒膿毒癥長期嚴(yán)重威脅著兒童生存及健康，可引起患兒長期的神經(jīng)功能障礙。因圍生期腦處于發(fā)育階段、血腦屏障的不完整，全身嚴(yán)重的感染可波及中樞，引起腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元軸突、突觸的病變，這可能是神經(jīng)功能障礙的原因之一，但其具體分子機(jī)制不清。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)主要炎癥細(xì)胞，嚴(yán)重的感染、應(yīng)激時在急性期處于激活狀態(tài)，大量增殖并釋放過量的炎癥因子，其中白介素-1β是主要的促炎因子之一。既往有研究表明白介素-1β與眾多神經(jīng)系統(tǒng)病變有關(guān)。而p38-

2、MAPK是與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的信號通路，且白介素-1β能激活這條信號通路導(dǎo)致下游蛋白的表達(dá)異常。因此在本研究中提出假設(shè):新生兒膿毒癥可出現(xiàn)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，釋放大量的白介素-1β，通過激活神經(jīng)元的p38-MAPK信號通路，導(dǎo)致神經(jīng)元、突觸相關(guān)重要蛋白的異常表達(dá)，可能是導(dǎo)致新生兒膿毒癥神經(jīng)軸突、突觸損傷的機(jī)制之一。
　　目的:
　　證實新生膿毒癥大鼠模型可出現(xiàn)神經(jīng)軸突、突觸的損傷、以及腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和白介素-1β的大

3、量表達(dá)，體外實驗證實白介素-1β可通過激活p38-MAPK導(dǎo)致神經(jīng)元、突觸相關(guān)重要蛋白的異常表達(dá)。
　　方法:
　　1.給予新生SD大鼠腹腔注射LPS，模擬膿毒癥模型，與腹腔注射PBS的對照組對比，蛋白印跡及免疫熒光注射后7天、14天、28天檢測軸突、突觸以及髓鞘相關(guān)的重要蛋白(PLP、NFL、NFM、NFH、Synaptophysin、PSD95)的表達(dá)，電鏡檢查腦內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的變化，通過免疫熒光和尼氏染色明確神經(jīng)元的凋亡情

4、況。2.給予新生SD大鼠腹腔注射LPS后通過蛋白印跡、免疫熒光觀察腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞是否激活、表達(dá)白介素-1β的量變化以及其受體的神經(jīng)元軸突上的表達(dá)情況。3.摸索理想濃度的白介素-1β干預(yù)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元，通過蛋白印跡和免疫熒光檢測軸突、突觸相關(guān)重要蛋白的表達(dá)。4.白介素-1β干預(yù)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元，檢測p38-MAPK信號通路的激活情況。使用p38-MAPK信號通路的抑制劑SB203580，將原代培養(yǎng)神經(jīng)元分為4個組:對照組、白介素-1β組

5、、白介素-1β+SB203580組、SB203580組，蛋白印跡檢測軸突、突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，以明確p38-MAPK介導(dǎo)了白介素-1β對于神經(jīng)元軸突、突觸蛋白表達(dá)的調(diào)控。
　　結(jié)果:
　　1.給予新生SD大鼠腹腔注射LPS后7天、14天、28天檢測到軸突相關(guān)蛋白(NFL、NFM、NFH)、突觸相關(guān)蛋白(Synaptophysin)、髓鞘相關(guān)蛋白(PLP)的表達(dá)均較對照組明顯下降(P＜0.05);電鏡下可見28天LPS組的白質(zhì)

6、區(qū)軸突的稀疏、髓鞘、郎飛結(jié)、軸突的破壞，對軸突的直徑統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)LPS組的軸突的直徑較對照組明顯變小(P＜0.05)，28天LPS組皮層區(qū)的部分神經(jīng)元、樹突呈“發(fā)黑”的表現(xiàn)，突觸囊泡腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體嵴的破壞;而尼氏染色和凋亡的檢測上在7天、14天、28天皮層神經(jīng)元的凋亡在LPS和對照組之間無明顯差異。2.腹腔注射LPS后6小時、2天、4天、6天發(fā)現(xiàn)胼胝體區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞呈圓形激活狀，數(shù)目有明顯增加，大量的表達(dá)白介素-1β，與相應(yīng)的對照組相比

7、，有顯著差異(P＜0.05);與此同時，相應(yīng)受體IL-1R1在神經(jīng)元的軸突上的表達(dá)也有明顯上調(diào)(P＜0.05)。3.原代神經(jīng)元培養(yǎng)后給予白介素-1β的干預(yù)，發(fā)現(xiàn)軸突(NFL、NFM)、突觸相關(guān)蛋白(Synaptophysin)的表達(dá)相對于對照組有明顯的下調(diào)(P＜0.05)，而使用IL-1R1的拮抗劑能拮抗白介素-1β的下調(diào)作用(P＜0.05）。4.白介素干預(yù)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元可在0.5小時即明顯上調(diào)p38-MAPK的磷酸化（P＜0.05）