缺氧在肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)TET酶表達(dá)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:肝細(xì)胞癌（肝細(xì)胞型肝癌）是一種原發(fā)性肝癌，也是常見的消化道惡性腫瘤之一。肝細(xì)胞癌早期癥狀不明顯，患者就醫(yī)時(shí)，多數(shù)已經(jīng)發(fā)展到了中晚期，失去了外科手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。其他的治療方法雖然眾多，但目前所有對(duì)肝細(xì)胞癌的治療方法還沒有達(dá)到令我們滿意的效果，因此急需一種能有效治療肝細(xì)胞癌的方法。
　　肝硬化被認(rèn)為是肝細(xì)胞癌的前期病理改變。C型肝炎病毒感染，過度飲酒和脂肪肝是引起肝硬化的主要因素。盡管肝細(xì)胞癌發(fā)病的分子機(jī)理尚不清楚，但綜合以

2、前的研究，目前認(rèn)為以下因素和肝細(xì)胞癌的發(fā)病有一定關(guān)系。(1)某些腫瘤基因調(diào)節(jié)的異常改變。如c-MYC，cyclin D1和β-catenin。(2)腫瘤抑制基因的改變。如pRb，DLC-1，P16INK4A，P53和E-cadherin。(3)全基因組DNA低甲基化和基因啟動(dòng)子CpG區(qū)域高甲基化的改變。
　　在肝細(xì)胞癌等實(shí)體腫瘤中，由于腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和瘤體內(nèi)血管形成異常，導(dǎo)致瘤體內(nèi)出現(xiàn)缺氧區(qū)域。在缺氧區(qū)域內(nèi)，缺氧誘導(dǎo)因子(HI

3、F-1α)的表達(dá)顯著升高。缺氧誘導(dǎo)因子調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、生存、遷移以及腫瘤實(shí)體內(nèi)血管的形成，最新研究表明缺氧調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的DNA甲基化水平。在甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的催化下，DNA鏈上兩個(gè)相鄰的核苷酸，胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)，胞嘧啶的第五位C被選擇性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。DNA甲基化是機(jī)體調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種方式。Anjana Rao等人在2009年報(bào)道哺乳動(dòng)物細(xì)胞有一種DNA雙加氧酶，即TET酶，可將5

4、-甲基胞嘧啶氧化成5-羥基胞嘧啶（5-hmC）。這種變化減少了DNA的甲基化，起到了基因活化的作用，增加了基因的表達(dá)。
　　最近的研究表明在肝細(xì)胞癌的組織樣品中5-羥基化胞嘧啶的含量和TET酶的表達(dá)水平和肝細(xì)胞癌周圍的正常組織相比顯著減少[13]。其他的研究表明低氧可在一些腫瘤細(xì)胞如SK-N-BE，NBL-WN，La1-55n，MCF7，和MDA-MB-231中，誘導(dǎo)TET1或TET3的表達(dá)，提高5-羥基化胞嘧啶的含量[37,38

5、]。
　　目前，在體外研究肝細(xì)胞型肝癌的最佳、最廣泛使用的是HepG2和Hep3B細(xì)胞株。本研究同時(shí)使用了HepG2和Hep3B兩種細(xì)胞株，擬探討缺氧在肝細(xì)胞型肝癌HepG2和Hep3B細(xì)胞中對(duì)TET酶的調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制。
　　主要結(jié)果和結(jié)論:一、缺氧能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2和Hep3B中TET酶的表達(dá)，升高細(xì)胞內(nèi)5-羥基胞嘧啶的含量
　　1、HepG2和Hep3B細(xì)胞表達(dá)三種TET酶亞型:TET1、TET2和T

6、ET3。用實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR)的方法檢測(cè)三種亞型在1％、5％和21％氧氣濃度條件下在HepG2和Hep3B細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果顯示TET1，TET2和TET3的表達(dá)在1％的氧氣條件下顯著高于21％的氧氣條件，表明缺氧能誘導(dǎo)TET酶的表達(dá)。
　　2、HepG2和Hep3B細(xì)胞培養(yǎng)在1％的氧氣濃度下，檢測(cè)TET酶三種亞型在不同時(shí)間的表達(dá)水平，如4小時(shí)，8小時(shí)，24小時(shí)。結(jié)

7、果顯示TET1，TET2和TET3的表達(dá)在8小時(shí)時(shí)明顯升高，更加確認(rèn)了缺氧可誘導(dǎo)TET酶的表達(dá)。
　　3、用免疫熒光化學(xué)的方法檢測(cè)到5-羥基胞嘧啶在細(xì)胞核的表達(dá)，結(jié)果顯示在1％的氧氣濃度條件下，5-羥基胞嘧啶的表達(dá)水平明顯高于21％的氧氣濃度，表明缺氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)5-羥基胞嘧啶的含量增加。
　　4、用點(diǎn)雜交的方法，定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的5-羥基胞嘧啶含量，結(jié)果顯示在1％的氧氣濃度條件下，5-羥基胞嘧啶的水平顯著升高，表明缺氧能升高細(xì)胞

8、內(nèi)5-羥基胞嘧啶的水平。
　　二、缺氧是通過缺氧誘導(dǎo)因子激活TET酶啟動(dòng)子的表達(dá)來誘導(dǎo)TET酶的表達(dá)
　　1、氯化鈷和缺氧一樣也會(huì)誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)。HepG2和Hep3B細(xì)胞培養(yǎng)在21％氧氣的條件下，用不同濃度的氯化鈷，如100μM、150μM、200μM處理24小時(shí)。結(jié)果顯示TET1、TET2、TET3的表達(dá)顯著升高，且隨氯化鈷濃度的增大而增加，表明在21％的氧氣濃度下氯化鈷也能誘導(dǎo)TET酶的表達(dá)。
　　2、在

9、21％氧氣條件下，HepG2和Hep3B細(xì)胞用150μM氯化鈷處理不同時(shí)間，如8小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)，結(jié)果顯示16小時(shí)時(shí)TET1、TET2、TET3的表達(dá)顯著升高，表明氯化鈷確實(shí)可以誘導(dǎo)TET酶的表達(dá)。
　　3、用ShRNA剔除HepG2和Hep3B細(xì)胞內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子后，TET1、TET2、TET3的表達(dá)在1％氧氣濃度條件下和在21％氧氣濃度條件下沒有明顯差異，表明缺氧誘導(dǎo)TET酶的表達(dá)是依賴于缺氧誘導(dǎo)因子。
　　4、

10、用ShRNA剔除HepG2和Hep3B細(xì)胞內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子后，在150μM氯化鈷處理24小時(shí)，TET1、TET2、TET3的表達(dá)沒有明顯變化，表明氯化鈷誘導(dǎo)TET酶的表達(dá)也是依賴于缺氧誘導(dǎo)因子。
　　5、TET酶的啟動(dòng)子含有缺氧誘導(dǎo)因子的結(jié)合序列，用螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法檢測(cè)到在HepG2和Hep3B細(xì)胞，TET1啟動(dòng)子螢光素酶的表達(dá)在1％的氧氣條件下明顯高于21％的氧氣條件。而當(dāng)缺氧誘導(dǎo)因子的結(jié)合序列被突變，破環(huán)了缺氧誘導(dǎo)因子的

11、結(jié)合時(shí)，螢光素酶的表達(dá)在1％的氧氣條件下和在21％的氧氣條件下沒有明顯變化，表明缺氧是通過缺氧誘導(dǎo)因子激活TET1啟動(dòng)子的表達(dá)。
　　綜上所述，我們的研究表明缺氧能夠誘導(dǎo)HepG2和Hep3B細(xì)胞TET酶的表達(dá)，升高5-羥基胞嘧啶的水平。和缺氧一樣，氯化鈷也能誘導(dǎo)TET酶的表達(dá)。缺氧和氯化鈷引起的細(xì)胞內(nèi)TET酶的升高是由缺氧誘導(dǎo)因子介導(dǎo)的。剔除細(xì)胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)或破壞缺氧誘導(dǎo)因子在TET酶啟動(dòng)子上的結(jié)合序列，可以阻止缺氧對(duì)T