間充質(zhì)干細胞治療三氯丙烷中毒性肝損傷.pdf

1、研究背景
　　現(xiàn)代工業(yè)的飛速發(fā)展,化學產(chǎn)品中毒事件不斷增加,其中三氯丙烷高劑量中毒導致的嚴重中毒性肝損傷,病情惡化快,常規(guī)保肝藥物、人工肝等治療效果有限,最終導致肝衰竭死亡。文獻報告骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)治療病毒性肝炎,肝硬化,甚至肝臟移植后肝臟損傷,肝功能生化指標較對照組明顯恢復。
　　利用BM-MSCs治療中毒性肝損傷的體內(nèi)、體外初期實驗發(fā)現(xiàn)有減少肝臟細胞死亡,促進其再生的作用,但MSC針對三氯丙烷(TCP)

2、中毒肝損傷治療未見文獻報道。因此,我們設(shè)計了MSC治療大鼠TCP中毒肝損傷模型,回答MSC是否可以歸巢中毒損傷肝臟,歸巢后干細胞變化規(guī)律,能否起到肝損傷修復作用,MSC的安全有效劑量,以及通過腺病毒轉(zhuǎn)染增效基因加強MSC修復功能等,為臨床救治提供實驗參照數(shù)據(jù)。
　　實驗方法與結(jié)果
　　1.分離、培養(yǎng)和鑒定大鼠骨髓MSC
　　取SPF級Wistar大鼠100g-130g,雄性,全骨髓貼壁分離法培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,至

3、第4代鏡下觀察細胞貼壁生長,形態(tài)統(tǒng)一,呈一致的梭形或長條形。取4代MSCs分別行流式細胞儀細胞表型檢測及成骨、成脂誘導分化實驗,結(jié)果顯示4代MSCs均表達CD105,CD44,不表達CD45和CD34,且在一定誘導條件下,成功向成骨、成脂肪誘導轉(zhuǎn)化。這就說明我們用的全骨髓貼壁分離篩選法可以獲得足夠量、生長旺盛、高純度、具有多向分化潛能的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　2.三氯丙烷致肝損傷大鼠動物模型建立
　　取40只健康SPF級

4、Wistar大鼠,雌性,體重200g±20g,隨機分為4組,每組各10只。A組,正常對照組(注射生理鹽水),B組,40ug/kg肝損傷模型組,C組,60ug/kg肝損傷模型組,D組,80ug/kg肝損傷模型組,隔日注射,分別在注射3次、5次、6次、7次取血標本,檢驗肝功能損害程度,檢驗項目包括:癥狀、體征,體重,及血液生化谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血清總蛋白(TP)、血清白蛋白(Alb)、總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)。,實驗

5、結(jié)果60ug/kg肝損傷模型組可出現(xiàn)明顯肝臟中毒癥狀、體征,及肝臟病理,生化指標變化,而40ug/kg組相對損傷輕,恢復快,80ug/kg相對損傷重,動物早期死亡率高。
　　3.骨髓間充質(zhì)干細胞在肝損傷大鼠肝臟歸巢研究
　　用長效熒光標記劑CM-DiI標記MSC作體內(nèi)示蹤觀察。具體方法:雄性大鼠的第4代6x106MSC細胞90％融合后,胰酶消化,用PBS稀釋DMSO溶解CM-DiI染劑,放37℃5min。PBS液洗,懸浮。M

6、SCs組:雌性大鼠三氯丙烷(TCP)染毒后1周,CM-DiI標記的雌性鼠的MSC1×106/只尾靜脈輸注;對照組,正常大鼠,不染毒,同樣尾靜脈輸注MSC1×106。將移植后3、15和30d的大鼠處死,取其肝臟包埋劑包埋后放入液氮冷凍,病理切片機連續(xù)切片,倒置熒光顯微鏡觀察照相。病理結(jié)果:正常大鼠輸入MSC細胞后12天,發(fā)現(xiàn)MSC細胞在骨髓和腸道增生活躍。染毒大鼠移植后15d,可見在受者肝臟中有少量標記細胞,主要集中在匯管區(qū),移植后30d

7、,肝臟中標記細胞進一步增加,出現(xiàn)形態(tài)改變,熒光匯集成片向肝小葉分布。
　　4.骨髓間充質(zhì)干細胞對三氯丙烷所致大鼠肝損傷的保護作用
　　75只SPF級Wistar大鼠,雌性,體重200g±20g,每組15只隨機分為5組:A組(正常對照組);B組(肝損傷模型組TCP+PBS)腹腔注射質(zhì)量分數(shù)為三氯丙烷60ug/kg,4h后經(jīng)尾靜脈注射1mlPBS;C組(高劑量MSCs治療組TCP+MSC)腹腔注射質(zhì)量分數(shù)為三氯丙烷60ug/kg

8、,4h后經(jīng)尾靜脈注射MSCs,1×106/只(重懸于1mlPBS中);D組(低劑量MSCs治療組TCP+MSCs)腹腔注射質(zhì)量分數(shù)為三氯丙烷60ug/kg,4h后經(jīng)尾靜脈注射MSCs-EGFP,1×105/只(重懸于1mlPBS中);E組(MSCs對照組MSCs+PBS)腹腔注射等量的PBS,4h后經(jīng)尾靜脈注射MSCs,1×106/只(重懸于1mlPBS中)。觀察各組大鼠的一般情況,血液肝功能,同時行肝組織病理學觀察。結(jié)果顯示MSCs治

9、療組大鼠肝損傷生化指標好于PBS組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　5.KGF基因通過腺病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠MSC實驗研究
　　為了將角質(zhì)生長因子(KGF)基因通過腺病毒載體轉(zhuǎn)染到MSC中,增強MSC修復功能。利用DNA重組技術(shù),將目的基因KGF克隆到含有報告基因EGFP的穿梭質(zhì)粒中,然后再將構(gòu)建的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至pAdxsi載體中,構(gòu)建重組腺病毒載體質(zhì)粒,繼而在H293細胞中包裝、擴增,并測定病毒滴度。轉(zhuǎn)染至小鼠MS

10、C中。為下步無關(guān)MSC輸注及基因改造MSC保證及放大MSC修復功能的干細胞活性實驗提供前期平臺。
　　結(jié)論
　　1、全骨髓貼壁分離法可成功分離純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,并在體外穩(wěn)定培養(yǎng)。2、60ug/kg三氯丙烷可成功建立大鼠肝臟中毒實驗模型。
　　3、熒光標記的MSCs可以在三氯丙烷中毒后損傷肝組織植入。
　　4、MSC可以歸巢到TCP染毒的大鼠肝損傷動物模型,并出現(xiàn)增值現(xiàn)象,同時有效的促進了損傷肝臟血清生化指