Ⅰ型干擾素和分泌IL-10的B細(xì)胞對(duì)新生期炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控.pdf

1、新生期(neonatal period)指的是動(dòng)物剛出生后的一段時(shí)間，人類為0至28天，而小鼠為0至7天。新生期動(dòng)物的一大特征是對(duì)病原微生物高度易感，獲得性免疫應(yīng)答(adaptive immune response)表現(xiàn)為抗體應(yīng)答水平低，T細(xì)胞免疫通常偏向Th2途徑。獲得性免疫應(yīng)答低下被認(rèn)為是新生期動(dòng)物對(duì)病原微生物高度易感一個(gè)因素，但其重要性及是否存在其它機(jī)制尚有待于進(jìn)一步闡明。天然免疫(innate immunity)是抵抗外源微生物

2、入侵的第一道防線，在抗感染免疫的早期起關(guān)鍵作用，同時(shí)天然免疫處于獲得性免疫的上游，不但為激活獲得性免疫所必需，而且決定獲得性免疫的方向和強(qiáng)度。天然免疫的啟動(dòng)是天然免疫細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別病原微生物中保守的分子配體而實(shí)現(xiàn)的，其中Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是最重要的一類受體。目前對(duì)新生期天然免疫的研究較少，且缺乏系統(tǒng)性，新生期天然免疫功能是否正常還存有爭(zhēng)議。本文以新生期小鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用體內(nèi)和體外實(shí)

3、驗(yàn)對(duì)新生期天然免疫系統(tǒng)進(jìn)行了比較全面的研究，證明了新生期天然免疫細(xì)胞在TLR配體的刺激下功能正常，揭示了CD5+B細(xì)胞對(duì)其它天然免疫細(xì)胞炎性應(yīng)答負(fù)調(diào)控的新機(jī)制，該機(jī)制為新生期動(dòng)物對(duì)病原微生物高度敏感的原因提供了新的可能解釋。 新生期小鼠對(duì)TLR配體的炎性應(yīng)答首先測(cè)定了新生期小鼠在注射TLR配體后體內(nèi)的炎性應(yīng)答，同時(shí)以成年鼠組作為對(duì)照。注射TLR9配體CpG后，從成年鼠的脾臟和肝臟中可檢測(cè)出高水平的炎性細(xì)胞因子(TNF-α，IL-

4、1β，IL-6和IL-12)，而在新生期小鼠的相應(yīng)器官未能或僅能檢測(cè)到很低水平的炎性細(xì)胞因子。與此對(duì)應(yīng)的是，絕大多數(shù)成年鼠死于D-氨基半乳糖(D-galactosamine)預(yù)致敏的、CpG誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而新生期小鼠卻在攻擊后存活。采用其它TLR配體(Pam3CSK4[TLR2-L]，Poly I：C[TLR3-L]，LPS[TLR4-L]和R848[TIR7-L])也得到類似的結(jié)果，這說(shuō)明與成年鼠相比，新生期小鼠在體內(nèi)炎性應(yīng)答方面存

5、在缺陷。在本實(shí)驗(yàn)條件下，炎性細(xì)胞因子主要由天然免疫系統(tǒng)的樹突細(xì)胞(dendriticcells，DC)和CDllb+髓系細(xì)胞(myeloid cells，包括單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞等)產(chǎn)生。為研究新生期小鼠的這些天然免疫細(xì)胞是否存在功能上的缺陷，采用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色或純化細(xì)胞的方法，測(cè)定了新生期常規(guī)樹突細(xì)胞(conventional dendritic cells，cDC)、漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(plasmacytoid dendrit

6、ic cells，pDC)和CDllb+髓系細(xì)胞在TLR配體刺激下分泌炎性細(xì)胞因子的能力。結(jié)果在這些體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與成年鼠相比，新生期天然免疫細(xì)胞功能上并不存在缺陷，刺激后可分泌正常水平的炎性細(xì)胞因子。白介素10(interleukin 10，IL-10)是最重要的炎性負(fù)調(diào)節(jié)分子之一。在CpG誘導(dǎo)的休克模型中，IL-10缺失的新生期小鼠顯示與野生型成年鼠相似的高敏感性，并在體內(nèi)產(chǎn)生高水平的炎性細(xì)胞因子，這說(shuō)明在新生期這個(gè)階段，小鼠在體

7、內(nèi)炎癥誘導(dǎo)方面不存在發(fā)育上的缺陷。 以上結(jié)果提示： 1 新生期小鼠天然免疫細(xì)胞本身功能正常，但在體內(nèi)存在著對(duì)這些天然免疫細(xì)胞炎性反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制，并且IL-10可能起關(guān)鍵作用。 2 新生期CD5+B細(xì)胞對(duì)新生期小鼠炎癥反應(yīng)的抑制IL-10缺失的新生期小鼠對(duì)CpG的高敏感性說(shuō)明了體內(nèi)產(chǎn)生的IL-10對(duì)炎性反應(yīng)控制的重要性。前期的研究發(fā)現(xiàn)，在CpG刺激下，小鼠新生期CD5+B細(xì)胞是抗炎細(xì)胞因子IL-10的主要來(lái)源。新

8、生期CD5+B細(xì)胞占全部B細(xì)胞的15％～30％，而這類細(xì)胞在成年鼠B細(xì)胞中的比例小于2％。除CpG外，CD5+B細(xì)胞也在其它TLR配體Pam3CSK4，LPS和R848刺激下產(chǎn)生大量的IL-10。體外共培養(yǎng)試驗(yàn)證明，來(lái)自于CD5+B細(xì)胞的IL-10抑制了新生期cDC，pDC和CDllb+髓系細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的能力，而且這種抑制不依賴于細(xì)胞間的直接接觸。 分泌IL-10的CD5+B細(xì)胞抑制新生期炎性應(yīng)答的重要性進(jìn)

9、一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。B細(xì)胞或CD5+B細(xì)胞缺失的新生期小鼠在注射CpG后，體內(nèi)的炎性細(xì)胞因子水平上升，并且恢復(fù)了對(duì)D-氨基半乳糖預(yù)致敏的休克模型的敏感性。在預(yù)先接受新生期B細(xì)胞或CD5+B細(xì)胞輸注后，IL-10缺失或B細(xì)胞缺失的新生期小鼠能夠免于CpG誘導(dǎo)的休克反應(yīng)。因此，分泌IL-10的CD5+B細(xì)胞在體內(nèi)控制了新生期小鼠的炎癥反應(yīng)。 3 I型干擾素通過(guò)分泌IL-10的CD5+B細(xì)胞控制新生期炎癥反應(yīng)在新生期小鼠pDC與

10、CD5+B細(xì)胞的共培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在CpG和R848刺激下，除了B細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10顯著抑制了pDC分泌I型干擾素(IFN-α和IFN-β)和其它炎性細(xì)胞因子外，CD5+B細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10顯著高于CD5+B細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的水平。這說(shuō)明pDC促進(jìn)了B細(xì)胞IL-10的分泌。在所測(cè)定的pDC產(chǎn)生的細(xì)胞因子中，只有IFN-α和IFN-β顯著提高CpG刺激下新生期B細(xì)胞IL-10的分泌。當(dāng)pDC與I型干擾素受體缺失的新生期B細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)

11、，pDC失去增強(qiáng)新生期B細(xì)胞分泌IL-10的能力，證實(shí)pDC產(chǎn)生的I型干擾素是促進(jìn)B細(xì)胞IL-10產(chǎn)生的關(guān)鍵分子。cDC和髓系細(xì)胞以相同的機(jī)制通過(guò)分泌I型干擾素來(lái)增加B細(xì)胞IL-10的產(chǎn)生。為進(jìn)一步研究I型干擾素在新生期炎性應(yīng)答中的作用，測(cè)定了I型干擾素受體缺失的小鼠體內(nèi)的炎性應(yīng)答。與野生型新生期小鼠相比，I型干擾素受體缺失的新生期小鼠在注射CpG后產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)，并且恢復(fù)對(duì)D-氨基半乳糖預(yù)致敏的休克模型的敏感性。相反的現(xiàn)象卻出現(xiàn)在

12、成年鼠，I型干擾素受體缺失的成年鼠比正常對(duì)照組產(chǎn)生顯著減弱的炎癥反應(yīng)，并且對(duì)CpG引發(fā)的休克模型不敏感。這說(shuō)明I型干擾素在成年期促進(jìn)而在新生期抑制炎癥反應(yīng)。 I型干擾素在新生期對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制依賴于CD5+B細(xì)胞和IL-10的存在，因?yàn)樵谌狈D5+B細(xì)胞或IL-10的情況下，I型干擾素促進(jìn)新生期炎性應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)只有野生型新生期小鼠B細(xì)胞，而不是I型干擾素受體缺失的新生期小鼠B細(xì)胞可以保護(hù)IL-10缺失的新生期小鼠免于CpG誘

13、導(dǎo)的致死性休克，從而進(jìn)一步說(shuō)明I型干擾素在體內(nèi)通過(guò)增強(qiáng)B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10來(lái)控制新生期小鼠的炎癥反應(yīng)。 結(jié)論: 新生期屬于一個(gè)特別的時(shí)期，一方面，生長(zhǎng)代謝旺盛且許多器官的發(fā)育還不完善，需要一個(gè)穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境。許多研究表明，這個(gè)時(shí)期的炎癥反應(yīng)將導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡。新生期面對(duì)大量的外源微生物，需要迅速建立針對(duì)這些炎癥誘導(dǎo)物的耐受，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。另一方面，新生期的炎癥反應(yīng)應(yīng)答低下將導(dǎo)致不能有效清除病原微生

14、物，從而造成對(duì)病原微生物的高度敏感。本研究表明，新生期小鼠的天然免疫細(xì)胞在功能上不存在缺陷，在TLR配體的刺激后可產(chǎn)生正常的炎性應(yīng)答，但是這種能力在體內(nèi)卻被一群分泌IL-10，具有負(fù)調(diào)節(jié)功能的CD5+B細(xì)胞亞群所控制，這種控制是受發(fā)育調(diào)控的，因?yàn)樾律谑荂D5+B細(xì)胞亞群發(fā)生的高峰期，隨著小鼠的生長(zhǎng)，CD5+B細(xì)胞的產(chǎn)生逐漸減少。另一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)是，I型干擾素顯著增加CD5+B細(xì)胞IL-10的分泌，而且在體內(nèi)CD5+B細(xì)胞負(fù)調(diào)節(jié)作用依賴