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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:
隨著廣譜抗生素和糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用,介入治療和器官移植的普遍開(kāi)展,艾滋病、腫瘤和糖尿病病人的增加,念珠菌感染呈逐年上升的趨勢(shì)。在臨床治療的過(guò)程中,由于抗真菌藥物的廣泛和長(zhǎng)期應(yīng)用導(dǎo)致了耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn),影響臨床治療效果,因此研究真菌耐藥的分子機(jī)制不僅有利于發(fā)現(xiàn)新的藥物治療靶點(diǎn)還能更好的指導(dǎo)臨床用藥。
氟康唑是1978年發(fā)現(xiàn)的氟代三唑類藥物,具有抗菌譜廣、半衰期長(zhǎng)(27-34h)、生物利用度高
2、、不良反應(yīng)發(fā)生率低、可通過(guò)血腦屏障等優(yōu)點(diǎn),是目前治療念珠菌感染的首選藥物。但長(zhǎng)期反復(fù)的應(yīng)用導(dǎo)致了氟康唑耐藥菌株的出現(xiàn)。
白念珠菌是念珠菌感染的首要致病菌。從基因水平研究白念珠菌對(duì)氟康唑耐藥機(jī)制的報(bào)道主要集中于歐美國(guó)家,國(guó)內(nèi)研究相對(duì)較少。目前研究認(rèn)為,白念珠菌耐藥主要有以下三種機(jī)制:(1)藥物靶酶基因ERG11突變或過(guò)度表達(dá);(2)外排泵基因(CDR1、CDR2、MDR1)的過(guò)度表達(dá);(3)生物膜的形成。
麥角
3、固醇是真菌細(xì)胞膜的特有脂質(zhì)。它維持著細(xì)胞膜的完整性和正常功能。細(xì)胞色素P450依賴的14α-去甲基化酶(Erg11 p)是麥角固醇合成途徑中的限速酶,其編碼基因?yàn)镋RG11基因。氟康唑可以與14α-去甲基化酶結(jié)合從而影響該酶的活性,進(jìn)而阻止麥角固醇的合成。ERG11基因的點(diǎn)突變可導(dǎo)致編碼蛋白的改變從而影響Erg11 p的空間構(gòu)象,引起Erg11 p與藥物的親和力降低或底物/藥物進(jìn)出通道發(fā)生改變。迄今報(bào)道的ERG11基因錯(cuò)義突變已逾160
4、種。
在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)14株氟康唑耐藥的白念珠菌僅含有G487T和T916C突變,且并不伴隨其它突變。最近有文章報(bào)道在人工誘導(dǎo)的氟康唑耐藥株中也同樣發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)突變。到目前為止,G487T和T916C兩突變僅在氟康唑耐藥菌株中出現(xiàn),但其與氟康唑耐藥的關(guān)系并未得到實(shí)驗(yàn)室證實(shí)。
目的:
運(yùn)用表達(dá)質(zhì)粒過(guò)表達(dá)和基因敲除的方法,研究ERG11基因6487T和T916C突變與白念珠菌氟康唑耐藥的關(guān)系。<
5、br> 方法:
1.白念珠菌GZ16和SC5314 MIC值的測(cè)定和ERG11基因突變檢測(cè)
應(yīng)用微量稀釋法對(duì)前期分離的氟康唑耐藥株GZ16和標(biāo)準(zhǔn)株SC5314(由Richard Calderone教授惠贈(zèng))進(jìn)行氟康唑MIC的測(cè)定。分別提取兩株菌的基因組DNA,參照白念珠菌ERG11標(biāo)準(zhǔn)序列(GeneBank X13296)設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增GZ16和SC5314的ERG11基因并測(cè)序。
2.E
6、RG11基因突變片段質(zhì)粒的構(gòu)建和釀酒酵母突變表達(dá)載體的構(gòu)建
以GZ16的ERG11基因?yàn)槟0?,通過(guò)重疊PCR得到無(wú)突變、含G487T突變、含T916C突變、含G487T和T916C兩突變的ERG11基因片段,膠回收純化后分別與T載體pGM-T連接得到質(zhì)粒pGM-N、pGM-487T、pGM-916C、pGM-TWO。以GZ16、pFA-CaURA3、pFA-SAT1為模板,通過(guò)PCR得到ERG11基因下游片段、URA3選擇
7、標(biāo)記片段、SAT1選擇標(biāo)記片段,經(jīng)膠回收純化分別與T載體pGM-T連接得到質(zhì)粒pGM-DOWN、pGM-URA3、pGM-SAT1。
用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別雙酶切質(zhì)粒pGM-916C、pGM-DOWN、pGM-URA3、和PCDNA3.1,得到具有粘性末端的4片段:含T916C突變的ERG11片段、URA3選擇標(biāo)記片段、ERG11基因下游片段和pCDNA3.1片段。4片段經(jīng)連接酶連接后得到以URA3為選擇標(biāo)記含突變片段的
8、質(zhì)粒pcDNA3.1-916C-URA3,該質(zhì)粒骨架為pcDNA3.1。重復(fù)以上步驟得到以URA3為選擇標(biāo)記的無(wú)突變的、含G487T突變、含G487T和T916C兩突變的突變片段質(zhì)粒pcDNA3.1-N-URA3、pcDNA3.1-487T-URA3、pcDNA3.1-TWO-URA3,以及以SAT1為選擇標(biāo)記的無(wú)突變的、含G487T突變的、含T916C突變的、含G487T和T916C兩突變的突變片段質(zhì)粒pcDNA3.1-N-SAT1、
9、pcDNA3.1-487T-SAT1、pcDNA3.1-916C-SAT1、pcDNA3.1-TWO-SAT1。
以pGM-N、pGM-487T、pGM-916C、pGM-TWO為模板,PCR擴(kuò)增,得到無(wú)突變、含G487T突變、含T916C突變、含G487T和T916C兩突變的ERG11基因片段,片段雙酶切后分別與釀酒酵母表達(dá)載體YEP351G連接得到釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒YEP351G-N、YEP351G-487T、YEP35
10、1G-916C和YEP351G-TWO。
3.含不同突變的YEP351G表達(dá)載體在釀酒酵母中的表達(dá)與氟康唑藥敏測(cè)定
采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化的方法,分別用質(zhì)粒YEP351G-N、YEP351G-916C、YEP351G-487T、YEP351G-TWO轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1,用亮氨酸缺陷的培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆,并測(cè)定陽(yáng)性克隆對(duì)氟康唑的MIC值。
4.白念珠菌T916C突變菌株的構(gòu)建與氟康唑敏感性測(cè)定
11、> 限制性內(nèi)切酶HindⅢ和NheⅠ雙酶切質(zhì)粒pcDNA3.1-916C-URA3得到相應(yīng)的長(zhǎng)度為3.7kb的敲除片段,醋酸鋰轉(zhuǎn)化白念珠菌CAI4,尿嘧啶缺陷的培養(yǎng)基選擇陽(yáng)性克隆,并測(cè)定陽(yáng)性克隆對(duì)氟康唑的MIC值。
結(jié)果:
1.白念珠菌GZ16和SC5314 MIC值的測(cè)定和ERG11基因突變檢測(cè)
白念株菌GZ16為我們以前實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的氟康唑耐藥菌株,經(jīng)5次傳代后其氟康唑MIC值仍為64μ
12、g/ml。標(biāo)準(zhǔn)株SC5314的氟康唑MIC值為2μ g/ml,為氟康唑敏感菌株。GZ16僅含有G487T和T916C突變。SC5314含有T462A、T495A、A504G、A530C、C558T、C805T、A1167G、A1587G突變,其中氨基酸錯(cuò)義突變?yōu)镕105L(T462A)、D116E(T495A)、K128T(A530C)。
2.ERG11基因突變片段質(zhì)粒的構(gòu)建和釀酒酵母突變表達(dá)載體的構(gòu)建
構(gòu)建
13、了以URA3為選擇標(biāo)記的ERG11基因突變片段質(zhì)粒pcDNA3.1-N-URA3、pcDNA3.1-487T-URA3、pcDNA3.1-916C-URA、pcDNA3.1-TWO-URA3,以及以SAT1為選擇標(biāo)記的 ERG11基因突變片段質(zhì)粒 pcDNA3.1-N-SAT1、pcDNA3.1-487T-SAT1、pcDNA3.1-916C-SAT1、pcDNA3.1-TWO-SAT1;并成功構(gòu)建了釀酒酵母突變表達(dá)載體YEP351G-
14、N、YEP351G-487T、YEP351G-916C和YEP351G-TWO。
3.YEP351G表達(dá)載體在釀酒酵母中的表達(dá)與氟康唑藥敏測(cè)定
用質(zhì)粒YEP351G-N、YEP351G-916C、YEP351G-487T、YEP351G-TWO轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1后,用亮氨酸缺陷的培養(yǎng)基成功篩選出相應(yīng)的陽(yáng)性克隆株INVSc1+N、INVSc1+487T INVSc1+916C、INVSc1+TWO,其對(duì)氟
15、康唑的MIC值分別為32μ g/ml、32μ g/ml、128μ g/ml、128μ g/ml,釀酒酵母INVSc1對(duì)氟康唑的MIC值為8μ g/ml。
4.白念珠菌T916C突變菌株的構(gòu)建與氟康唑敏感性測(cè)定
在T916C突變菌株的構(gòu)建中用尿苷缺陷的培養(yǎng)基成功得到5株陽(yáng)性克隆株(T1-T5),其中有3株存在T916C突變(T1、T3、T5),而兩株雖然發(fā)生了同源重組但無(wú)T916C突變(T2、T4)。CIA-4
16、、T1、T2、T3、T4、T5對(duì)氟康唑的MIC值分別為2μ g/ml、4μ g/ml、2μ g/ml、4μ g/ml、2μ g/ml、4μ g/ml。
結(jié)論:
1.成功構(gòu)建了含白念珠菌ERG11基因G487T和T916C突變的突變片段質(zhì)粒和能表達(dá)白念珠菌ERG11基因G487T和T916C突變的釀酒酵母突變表達(dá)載體。
2.首次證實(shí)了白念珠菌ERG11基因T916C突變與氟康唑耐藥有關(guān)。
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