構(gòu)建白血病免疫學(xué)分型細(xì)胞芯片的片基選擇及最佳修飾方法的研究.pdf

1、目的： 隨著大量抗白細(xì)胞表面分化抗原單克隆抗體的問(wèn)世，應(yīng)用其來(lái)檢測(cè)白血病細(xì)胞表面分化抗原，以確定其細(xì)胞系列來(lái)源及發(fā)育階段，推動(dòng)了白血病免疫學(xué)分型的研究，提高了白血病診斷的準(zhǔn)確性。目前常用的進(jìn)行白血病免疫學(xué)分型的方法有免疫組化法、免疫熒光法，但這兩種方法存在很多缺陷。前者不能同時(shí)進(jìn)行多種抗原檢測(cè)；檢測(cè)一種抗原需要的單克隆抗體量較多，不經(jīng)濟(jì)；處理步驟多，費(fèi)時(shí)。后者同時(shí)檢測(cè)抗原種類有限；檢測(cè)所需的熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀設(shè)備昂貴。對(duì)細(xì)胞

2、高通量研究的要求與芯片技術(shù)的結(jié)合使細(xì)胞芯片應(yīng)運(yùn)而生，這種新型的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)的出現(xiàn)，克服了上述方法的缺陷，使白血病的免疫學(xué)分型高通量診斷更快捷、方便。 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的用于白血病免疫學(xué)分型的細(xì)胞芯片就是利用抗原、抗體特異性結(jié)合的原理，將白細(xì)胞表面分化抗原單克隆抗體固定于載體上，形成抗體點(diǎn)陣。不同的單克隆抗體能夠自動(dòng)識(shí)別和捕獲表達(dá)相應(yīng)表面分化抗原的細(xì)胞，從而對(duì)白血病進(jìn)行免疫學(xué)分型。 載體選擇是芯片制備過(guò)程中的第一個(gè)關(guān)鍵步驟。選

3、擇何種載體及如何修飾才能使單克隆抗體更牢固、更特異性地固定在載體表面，同時(shí)使固相支持物表面的蛋白保持最大的活性，是影響該技術(shù)檢測(cè)成功率的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)欲探索制備細(xì)胞芯片的最佳載體及載體的最佳修飾方法。 方法： 1、制備5種片基分別對(duì)玻片進(jìn)行氨基硅烷-醛基修飾、殼聚糖-氨基修飾、殼聚糖.醛基修飾、巰基修飾；聚苯乙烯板蒸餾水超聲清洗備用。 2、確定5種片基的最佳點(diǎn)樣緩沖液pH值分別用含3％甘油的pH值為6.0、7.2、

4、8.5的磷酸鹽緩沖液和pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液，1∶4稀釋CD單抗，在5種片基上點(diǎn)制抗體點(diǎn)陣，水化、封閉、清洗。取新鮮正常人的外周血2ml，用本實(shí)驗(yàn)室自配的全白細(xì)胞分離液提取白細(xì)胞(>1×10<'6>/ml)，丫叮橙染色、清洗，孵育芯片45分鐘，PBS清洗至背景干凈，掃描，分析不同片基的最佳點(diǎn)樣緩沖液pH值。 3、確定5種片基固定抗體的飽和濃度將原濃度是200μg/ml的CD單抗分別按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶3

5、2、1∶64稀釋后，在5種片基上按濃度下降的次序點(diǎn)樣， FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG溶液(濃度100μg/ml)孵育30分鐘，分析不同片基固定抗體的飽和濃度。 4、確定5種片基固定抗體的最佳時(shí)間在5種片基上固定CD單抗，分別在濕盒中4℃水化0.5、1、2、4、12、24、48小時(shí)，F(xiàn)ITC標(biāo)記IgG溶液孵育，分析不同片基固定抗體的最佳時(shí)間。 5、檢測(cè)5種片基的蛋白結(jié)合力在5種片基上固定FITC標(biāo)記的熒光抗體，比較不同片基的

6、平均熒光信號(hào)強(qiáng)度及不同部位熒光信號(hào)強(qiáng)度的變異率。 6、檢測(cè)5種片基固定的蛋白活性及保存時(shí)間對(duì)蛋白活性的影響在芯片制備后1天、1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月，分別用熒光標(biāo)記抗體和熒光標(biāo)記細(xì)胞來(lái)檢測(cè)蛋白的活性。 結(jié)論： 氨基硅烷-醛基玻片在以pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液作為點(diǎn)樣緩沖液，固定蛋白的濃度為50μg/ml，固定時(shí)間大于12小時(shí)的條件下，對(duì)蛋白的固定效率及固定蛋白的反應(yīng)性最好，且明顯優(yōu)于其他片基，可做為制備白血病免疫