重組人乙酰膽堿受體α亞基1-210誘導實驗性重癥肌無力模型.pdf

1、背景：重癥肌無力(MG)是一種主要累及神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜乙酰膽堿受體(AChR)，由乙酰膽堿受體抗體(AchR-ab)介導的自身免疫性疾病。發(fā)病率高達8～20/10萬，并有逐年上升的趨勢；且致殘率高，嚴重危害人類健康，尋找有效治療手段一直是研究者們努力的方向。實驗性重癥肌無力(EAMG)是其基礎研究的動物模型；構(gòu)建該模型的經(jīng)典方法是由電鰻電器管中提取的純化AchR作為免疫原，電鰻難以捕獲，且提取過程復雜、費用昂貴，因此尋找構(gòu)建該模型的

2、新方法成為當務之急。AChR的主要生物學功能單位是α亞基，它具有高度的免疫原性，有研究證實刺激α亞基或α亞基的某些肽段，可以激活AChR特異反應性T細胞發(fā)生免疫反應。用含有免疫表位的α亞基的某些肽段作為免疫原誘導EAMG模型是近幾十年來研究者們追求的目標；但可能是由于用作免疫原的肽段多在20個殘基左右、免疫位點少、免疫原性較弱、須大劑量重復注射且肌無力存在時間短暫，不能成為理想的動物模型。AchRα亞基的N端細胞外區(qū)域1-210位殘基，

3、包含了ACh配體的結(jié)合位點和主要免疫原區(qū)，是MG致病的關(guān)鍵區(qū)域，可以推測該肽段有可能成為有效免疫原。九十年代初Talib就應用基因技術(shù)分段克隆了hAChRα1-210片段，并在大腸桿菌中誘導表達；構(gòu)建EAMG模型的知名專家Lennon則以該表達產(chǎn)物免疫Lewis鼠，結(jié)果成功誘導EAMG模型。隨著分子生物學的發(fā)展，應用分子克隆和表達技術(shù)重組目的基因的方法已非常成熟；但國內(nèi)外均未見使用類似方法誘導EAMG模型的報道。 目的：我們首次

4、參照Talib文獻克隆并在大腸桿菌中誘導表達了hAChRα1-210，然后用該表達產(chǎn)物免疫Lewis鼠誘導EAMG模型，希望為MG的基礎研究提供一個簡便、易行的實驗動物模型。 方法：本研究參照Talib和Lennon的文獻并加以改進，首先RT-PCR擴增出目的基因AChRα1-210片段，然后將構(gòu)建的表達載體在大腸桿菌中誘導表達，最后將表達產(chǎn)物作SDS-PAGE和免疫鑒定確認為rhAChRα1-210。接著將凝膠上的rAChRα

5、1-210融合蛋白與完全氟氏佐劑(CFA)充分乳化后，按一定的劑量經(jīng)皮下多點注入6-8周齡雌性Lewis鼠，并在4周后強化接種一次。觀察免疫后鼠體重的變化，并給予Lennon臨床評分；低頻重復電刺激檢查電衰減率和ELISA法檢測血清AchR-ab滴度作為評價造模是否成功的客觀依據(jù)。 結(jié)果：編碼人骨骼肌乙酰膽堿受體α亞基的細胞外區(qū)域1-210殘基被成功克隆，并被轉(zhuǎn)入一個可誘導的表達載體中，最后在大腸桿菌中大量誘導表達。表達產(chǎn)物經(jīng)電

6、泳和免疫雙重鑒定確認為hAChRα1-210，然后與CFA充分乳化后免疫Lewis鼠。在第二次免疫后約10天實驗組鼠出現(xiàn)了體重下降及肌無力，且隨著時間延長肌無力癥狀更加明顯。至實驗結(jié)束時經(jīng)Lennon臨床評分達1級以上者占實驗組的70％。低頻重復電刺激檢查證實該7只實驗組鼠的D5比值均超過10％；ELISA法檢測血清AchR-ab滴度，有肌無力表現(xiàn)的7只實驗鼠均為陽性，對照組有1例可疑陽性，其余均為陰性。 結(jié)論：我們應用分子克隆