重癥肌無(wú)力易受累肌群乙酰膽堿受體的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　神經(jīng)肌肉接頭(Neuromuscular Junction，NMJ)是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢與肌肉相連接的部位，也是突觸傳遞的一種，截至目前為止在眾多的突觸結(jié)構(gòu)中，其研究最多且了解是最清楚的，而NMJ以及整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)突觸的信號(hào)傳遞本質(zhì)就是突觸前、后膜特化性改變的過(guò)程：軸突末梢釋放神經(jīng)遞質(zhì)被突觸后細(xì)胞接收，經(jīng)過(guò)電信號(hào)一化學(xué)信號(hào)一電信號(hào)的轉(zhuǎn)換，傳遞具有有效和準(zhǔn)確的特點(diǎn)。在神經(jīng)肌肉傳遞過(guò)程中乙酰膽堿受體擔(dān)任著非常重要的角色，煙堿型

2、乙酰膽堿是配體型離子門(mén)控通道家族的代表，是具有重要生理作用的細(xì)胞膜蛋白，廣泛表達(dá)于整個(gè)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，而并非只在神經(jīng)肌肉系統(tǒng)表達(dá)，膽堿能信號(hào)傳遞給乙酰膽堿受體，調(diào)節(jié)生物體的一系列生理功能，如:肌肉興奮收縮、睡眠、痛覺(jué)、認(rèn)知等。其數(shù)量與分布影響著神經(jīng)肌肉的功能狀態(tài)，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于nAChR亞單位在肌肉中表達(dá)量研究，主要側(cè)重于重癥肌無(wú)力大鼠中某肌群乙酰膽堿受體含量測(cè)定，卻極少研究乙酰膽堿受體在正常大鼠各肌群中表達(dá)量，本研究利用激光共聚焦

3、技術(shù)，觀察不同肌群乙酰膽堿受體形態(tài)學(xué)特征及神經(jīng)纖維與突觸后膜的的關(guān)系；通過(guò)qPCR測(cè)定乙酰膽堿受體mRNA水平，分析重癥肌無(wú)力患者易受累肌群與乙酰膽堿受體含量之間的關(guān)系。
　　目的：
　　通過(guò)對(duì)大鼠不同肌群乙酰膽堿受體形態(tài)學(xué)觀察和含量測(cè)定，部分解釋自身免疫性重癥肌無(wú)力肌群易受累的原因。
　　方法：
　　1.免疫熒光法觀察各組肌肉中乙酰膽堿受體的形態(tài)雄性SD大鼠300g，用10％水合氯醛，0.7ml/100g（腹腔

4、注射）麻醉大鼠，待麻醉完全后，取出腓腸肌、前肢肌、咀嚼肌、胸鎖乳突肌、眼外肌、肋間肌、膈肌、心肌共8組肌群，分別標(biāo)記為 A、B、C、D、F、G、H、P組。各肌群肌肉組織標(biāo)本先放入冰 PBS緩沖液中洗滌兩次，然后用4%多聚甲醛固定10min，放載玻片上顯微鏡下剝離出單根肌絲，PBS緩沖液洗5min*3次，用5%BSA固定60min。傾去BSA即可，直接滴加稀釋濃度為1：200的 SV2和2H3染色，37℃孵育60min。PBS緩沖液洗5m

5、in*3次，加入稀釋濃度為1：220的α-銀環(huán)蛇毒素和1：300的A-F488標(biāo)記的二抗染色，37℃孵育60min，PBS洗5min*3次。封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。
　　2.熒光定量 PCR法用5%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，迅速取出腓腸肌、前肢肌、咀嚼肌、胸鎖乳突肌、眼外肌、肋間肌、膈肌、心肌共8組肌群，分別標(biāo)記為A、B、C、D、F、G、H、P組。用預(yù)冷水洗滌2次,在液氮下快速研磨得到勻漿，每組肌群各稱(chēng)取60mg肌肉勻漿。用Tr

6、izoil一步法從勻漿中提取總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用熒光定量PCR法檢測(cè)，PCR后得到擴(kuò)增曲線,設(shè)置基線和閾值后,確定Ct值。因肌肉中α1、β1、δ、ε、γ亞基均有表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)從中選取β1作為研究對(duì)象，檢測(cè)其在成年大鼠不同肌群中的表達(dá)含量有無(wú)差異。查閱文獻(xiàn)得知β1亞基引物序列為：上游引物5'-ATAGCTCAGTAAGGCCGGCG-3'下游引物5'-TAGGTGACCTGGATGCTGCA-3'擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：35

7、5bp；內(nèi)參 GAPDH引物序列為：上游引物5'-ATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG-3'下游引物5'-GAAGACACCAGTAGACTCC ACGACA-3，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：170bp。
　　結(jié)果：
　　1.激光共聚焦顯微鏡下觀察肌肉中乙酰膽堿受體的形態(tài)成束肌纖維上可看到多個(gè)乙酰膽堿受體，集中分布在肌絲中部，呈排狀分列。紅色熒光染色區(qū)域?yàn)橐阴Ｄ憠A受體，在肌絲表面可見(jiàn)多個(gè)形態(tài)相似呈突起狀曲奇餅干樣，連續(xù)光滑有

8、精細(xì)分支的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，輪廓線均清晰流暢。綠色熒光染色區(qū)域?yàn)檠丶〗z分布的神經(jīng)纖維，且繞乙酰膽堿受體周?chē)蕡F(tuán)狀分布。Merge圖可見(jiàn)綠色團(tuán)狀神經(jīng)纖維軸突與紅色乙酰膽堿受體重合呈橙色。
　　2.qPCR法檢測(cè)乙酰膽堿受體β1亞基結(jié)果8組肌群煙堿型乙酰膽堿受體肌肉中β1亞基的表達(dá)量之間有差異（P〈0.05)。表達(dá)量從低到高依次為眼肌、咀嚼肌、前肢、心肌、膈肌、胸鎖乳突肌、肋間肌、腓腸肌，組間比較腓腸肌、肋間肌、胸鎖乳突肌、咀嚼肌、眼肌之間