AGEs-Cyr61信號(hào)通路在糖尿病小鼠激光誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管生成中的作用及其機(jī)制.pdf

1、【研究背景】脈絡(luò)膜新生血管（CNV）至少與40余種眼部疾病相關(guān)，常見(jiàn)于年齡相關(guān)性黃斑病變（AMD）、病理性近視黃斑變性、特發(fā)性CNV、眼組織胞漿菌病綜合征以及眼外傷等，其中AMD是發(fā)達(dá)國(guó)家老年人視力喪失的首要原因。上述嚴(yán)重威脅視功能的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病具有共同的病理學(xué)特征，即CNV形成。因此，闡明CNV發(fā)生機(jī)理和臨床防治策略已然成為近年來(lái)眼科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。
　　目前，已證實(shí)CNV發(fā)生的危險(xiǎn)因素主要包括年齡、吸煙、遺傳及

2、心血管疾病等，而糖尿病作為心血管疾病明確的誘因，其與CNV發(fā)生的相關(guān)性研究已逐漸受到學(xué)者們關(guān)注。目前，臨床流行病學(xué)調(diào)查是針對(duì)上述疾病開展的主要研究形式；然而，深入系統(tǒng)的基礎(chǔ)理論研究尚缺乏，糖尿病影響CNV發(fā)生的分子機(jī)制仍不清楚。
　　前期的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高血糖對(duì)CNV發(fā)生、發(fā)展具有十分重要的作用，主要證據(jù)包括：①糖尿病可加重鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠實(shí)驗(yàn)性CNV的嚴(yán)重程度；②給予糖尿病小鼠抗氧化劑治療可明顯緩解其氧化損傷

3、程度，從而阻斷與血管新生相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路，導(dǎo)致下游細(xì)胞因子的分泌量減少，降低CNV生成風(fēng)險(xiǎn)；③高血糖增加RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而上調(diào)VEGF的表達(dá)；④高血糖可通過(guò)上調(diào) RPE細(xì)胞中 VEGF的表達(dá)促進(jìn)骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞趨化至CNV區(qū)域并參與血管發(fā)生，從而加劇CNV的嚴(yán)重程度。
　　富半胱氨酸61（Cyr61）作為一種十分重要的細(xì)胞基質(zhì)調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞的增殖、粘附、侵襲與轉(zhuǎn)移以及血管生成、炎癥發(fā)生和組織重塑等重要生理、病理

4、過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，其是利用 Agilent Mouse基因表達(dá)譜芯片對(duì)CNV小鼠及糖尿病條件下CNV小鼠RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體進(jìn)行差異分析獲得的基因。Cyr61及其介導(dǎo)的信號(hào)通路是否參與CNV的生成，其中具體的分子機(jī)制是什么？對(duì)于上述問(wèn)題的回答必將為CNV的防治提供新的策略。
　　【目的】索AGEs-Cyr61信號(hào)通路對(duì)糖尿病小鼠激光誘導(dǎo)CNV形成的調(diào)節(jié)作用及具體分子機(jī)理，為 CNV的臨床防治開拓新的靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

5、
　　【方法】
　　一、Cyr61在糖尿病模型小鼠CNV生成中的表達(dá)狀態(tài)分析
　?。?）實(shí)驗(yàn)分組：將 C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組、糖尿病組及糖尿病+氨基胍治療組，每組20只；（2）動(dòng)物模型：腹腔連續(xù)5 d注射STZ構(gòu)建小鼠糖尿病模型，模型構(gòu)建成功2 w后，應(yīng)用532 nm倍頻激光誘導(dǎo)CNV生成；激光光凝后14 d：（3）脈絡(luò)膜鋪片：將RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體鋪展進(jìn)行血管染色，通過(guò)脈絡(luò)膜鋪片血管染色，

6、三維重建比較各組CNV體積；（4）組織病理學(xué)檢查：通過(guò)HE染色觀察各組CNV的高度和厚度差異；（5）組織免疫熒光染色：制備冰凍切片，抗體標(biāo)記脈絡(luò)膜組織，分析Cyr61與VEGF的表達(dá)定位情況；（6）ELISA實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)脈絡(luò)膜組織中Cyr61和VEGF分泌量。
　　二、Cyr61對(duì)糖尿病小鼠CNV生成的影響
　?。?）實(shí)驗(yàn)分組：將 C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為三組——正常對(duì)照組、糖尿病組及糖尿病+Cyr61單克隆抗體治療組，每

7、組20只；（2）動(dòng)物模型：腹腔連續(xù)5 d注射STZ構(gòu)建小鼠糖尿病模型，模型構(gòu)建成功2 w后，應(yīng)用532 nm倍頻激光誘導(dǎo)CNV生成；激光光凝后14 d：（3）脈絡(luò)膜鋪片：將RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體鋪展進(jìn)行血管染色，通過(guò)脈絡(luò)膜鋪片血管染色，三維重建比較各組CNV體積；（4）組織病理學(xué)檢查：通過(guò)HE染色觀察各組CNV的高度和厚度差異；（5）組織免疫熒光染色：制備冰凍切片，抗體標(biāo)記脈絡(luò)膜組織，分析Cyr61與VEGF的表達(dá)定位情況；（6）E

8、LISA實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)脈絡(luò)膜組織中Cyr61和VEGF分泌量；（7）體外細(xì)胞行為學(xué)實(shí)驗(yàn)：建立RPE細(xì)胞與CEC細(xì)胞共培養(yǎng)體系，分別使用MTT、Transwell和管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因沉默RPE細(xì)胞中Cyr61表達(dá)后，CEC細(xì)胞活力、移行數(shù)量和管腔形成長(zhǎng)度；
　　三、AGEs對(duì)Cyr61的表達(dá)調(diào)控及其分子機(jī)制
　　（1）實(shí)驗(yàn)分組：以RPE為細(xì)胞模型，分為六組——正常對(duì)照組、高糖處理組、10μg/mL BSA-AGEs處理組、50μ

9、g/mL BSA-AGEs處理組、100μg/mL BSA-AGEs處理組和sRAGE處理組；（2）Real-time PCR實(shí)驗(yàn)：給予各處理組作用后，觀察Cyr61 mRNA表達(dá)水平變化；（3）Western-blot：給予各處理組作用后，檢測(cè)Cyr61、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38、p-p38、Stat3h和p-Stat3等蛋白表達(dá)水平變化；（4）雙熒光素酶報(bào)告基因：轉(zhuǎn)染pCMV-Stat質(zhì)粒，分析Cy

10、r61轉(zhuǎn)錄活性情況；（5）ChIP實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞經(jīng)甲醛交聯(lián)、超聲破碎、免疫共沉淀和RT-PCR后，行瓊脂糖凝膠電泳比較條帶明暗程度。
　　四、Cyr61對(duì)VEGF的表達(dá)調(diào)控及其分子機(jī)制
　?。?）細(xì)胞模型：原代培養(yǎng)CEC細(xì)胞，將其作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象；（2）RT-PCR實(shí)驗(yàn)：40 ng/mL重組Cyr61作用細(xì)胞0、30、60、90、120 min，觀察VEGF mRNA表達(dá)水平變化；（3）Western-blot：給予各處理組

11、作用后，檢測(cè)VEGF、FAK、p-FAK、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IKK、p-IKK、IκB、MMP2和MMP13等蛋白表達(dá)水平變化；（4）細(xì)胞免疫熒光：采用激光共聚焦顯微鏡，觀察NF-κB細(xì)胞內(nèi)定位情況變化。
　　【結(jié)果】
　　一、Cyr61在糖尿病模型小鼠CNV生成中的表達(dá)狀態(tài)分析
　?。?）AGEs抑制劑氨基胍可緩解糖尿病小鼠CNV生成的嚴(yán)重程度：光凝后14d， STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠RPE層

12、和Bruch膜出現(xiàn)破裂，RPE細(xì)胞有較明顯增殖和遷移，新生血管增多，較正常小鼠 CNV體積顯著增大，而給予氨基胍治療，糖尿病小鼠CNV生成量明顯減少，CNV的厚度和高度顯著降低；（2）阻斷AGEs形成可下調(diào)Cyr61和VEGF的表達(dá)：糖尿病小鼠CNV區(qū)域Cyr61和VEGF呈高表達(dá)狀態(tài)，氨基胍不僅可抑制AGEs的形成，還可降低糖尿病小鼠眼部Cyr61及VEGF的分泌量。
　　二、Cyr61對(duì)糖尿病小鼠CNV生成的影響
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13、1）Cyr61單克隆抗體可降低糖尿病小鼠CNV生成的嚴(yán)重程度：光凝后14d， STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠RPE層和Bruch膜出現(xiàn)破裂，RPE細(xì)胞有較明顯增殖和遷移，新生血管增多，較正常小鼠CNV體積顯著增大，而給予Cyr61單克隆抗體治療，糖尿病小鼠 CNV生成量明顯減少，CNV的厚度和高度顯著降低；（2）特異性阻斷Cyr61可減少Cyr61和VEGF的表達(dá)量：糖尿病小鼠CNV區(qū)域Cyr61和VEGF呈高表達(dá)狀態(tài)，玻璃體腔注射Cyr61單

14、克隆抗體可顯著性降低糖尿病小鼠眼部Cyr61及VEGF的分泌量；（3）基因沉默Cyr61表達(dá)能夠顯著性抑制CEC細(xì)胞增生、移行和管腔形成：與 AGEs處理組相比，腺病毒感染組 CEC細(xì)胞增殖率下降32％、細(xì)胞遷移數(shù)量降低67%、管腔形成長(zhǎng)度減少29%。
　　三、AGEs對(duì)Cyr61的表達(dá)調(diào)控及其分子機(jī)制
　?。?）AGEs通過(guò)與受體RAGE結(jié)合調(diào)控Cyr61的表達(dá)：隨著AGEs刺激濃度增加，Cyr61表達(dá)水平逐漸升高，而游離

15、的 RAGE可抑制上述正相關(guān)效應(yīng)；（2）JNK信號(hào)通路介導(dǎo)AGEs對(duì)Cyr61的表達(dá)調(diào)控：AGEs可促進(jìn)MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白ERK1/2、JNK和p38磷酸化，但僅阻斷 JNK信號(hào)通路可下調(diào)Cyr61的表達(dá)；（3） AGEs通過(guò)JNK信號(hào)通路促使轉(zhuǎn)錄因子Stat3活化：生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Cyr61啟動(dòng)子區(qū)存在Stat3結(jié)合位點(diǎn)，阻斷JNK信號(hào)通路可顯著性逆轉(zhuǎn)AGEs致Stat3磷酸化水平升高；（4）轉(zhuǎn)錄因子Stat3增強(qiáng)Cyr61啟

16、動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性：轉(zhuǎn)錄因子Stat3與Cyr61基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1351至-1333 bp啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)Cyr61的表達(dá)。
　　四、Cyr61對(duì)VEGF的表達(dá)調(diào)控及其分子機(jī)制
　?。?）Cyr61通過(guò)與整合素受體αVβ3結(jié)合調(diào)控VEGF表達(dá)：封閉整合素受體αVβ3可顯著性下調(diào)VEGF的表達(dá)，而封閉整合素受體αVβ5和α5β1，未見(jiàn)VEGF表達(dá)量有變化；（2）FAK-PI3K信號(hào)通路參與VEGF的表達(dá)調(diào)控：在重組

17、蛋白Cyr61的作用下， CEC細(xì)胞內(nèi) FAK-PI3K/AKT信號(hào)通路被激活，且上述信號(hào)通路參與調(diào)控 CEC細(xì)胞VEGF的表達(dá)；（3）Cyr61促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子NF-kB細(xì)胞核轉(zhuǎn)位：Cyr61刺激組6 h，染色主要集中于細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞漿中較少；與Cyr61刺激組比較，F(xiàn)AK抑制劑作用6 h時(shí)，細(xì)胞漿染色較細(xì)胞核內(nèi)深；（4）Cyr61促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2/MMP13的表達(dá)：與正常對(duì)照組相比，CEC細(xì)胞在Cyr61的作用下，MMP2、M

18、MP13表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）。
　　【結(jié)論】AGEs可通過(guò)與RPE細(xì)胞表面受體RAGE結(jié)合，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Stat3活化，進(jìn)而調(diào)控Cyr61的表達(dá)；Cyr61不僅可激活CEC細(xì)胞內(nèi)整合素-PI3K/AKT信號(hào)，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB核轉(zhuǎn)位上調(diào)VEGF，還對(duì)MMP2/MMP13具有重要的調(diào)控作用；抑制AGEs的形成或特異性阻斷Cyr61，能夠顯著性地抑制CEC細(xì)胞增生、移行和管腔形成，從而起到緩解糖尿病所致 CNV嚴(yán)重程度的