Cystatin M和Cathepsin B單-雙基因共表達載體轉(zhuǎn)染對乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移抑制作用的體外研究.pdf

1、目的：通過對人Cystatin M(CST6)和反義Cathepsin B(CB)基因克隆和表達，觀察CST6和反義CB單/雙基因表達對乳腺癌細胞體外增殖、黏附、遷移及侵襲能力的影響，為進一步探討CST6和反義CB抗乳腺癌作用機制提供理論依據(jù)。 方法：PCR一步法擴增CB目的片段，基因克隆技術構(gòu)建pBudCE4.1-CB及pBudCE4.1-CB-CST6重組載體。PCR、酶切、測序方法篩選陽性重組質(zhì)粒。脂質(zhì)體法將單基因重組質(zhì)粒

2、和CST6及反義CB雙基因共表達載體導入具有高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性的人乳腺癌細胞株MDA-MB-231；Western-blot方法鑒定CST6和CB蛋白表達；噻唑蘭比色(MTT)法和免疫組化Ki-67檢測CST6和反義CB表達對MDA-MB-231細胞增殖能力的影響；體外黏附實驗檢測其表達對MDA-MB-231細胞與基質(zhì)(Matrigel)、纖維連接素(Fibronectin)黏附能力的影響；Transwell體外侵襲實驗觀察轉(zhuǎn)染后腫瘤細

3、胞遷移和侵襲能力的變化。 結(jié)果： 1.應用基因克隆技術建立pBudCE4.1/CB重組載體和CST6及反義CB雙基因共表達載體pBudCE4.1-CB-CST6，并瞬時轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞株MDA-MB-231。 2.體外增殖實驗顯示：單基因轉(zhuǎn)染組MDA/CB和MDA/CST6細胞的增殖能力與空載體組、未轉(zhuǎn)染組細胞相比明顯下降(P<0.01)；同時雙基因轉(zhuǎn)染組MDA/CB-CST6細胞的增殖能力較MDA/CB和MDN

4、CST6細胞更進一步受到顯著抑制(P<0.01)。 3.在黏附實驗、Transwell侵襲運動實驗中，與未轉(zhuǎn)染組、空載體對照組相比，單基因轉(zhuǎn)染組MDA/CB和MDA/CST6細胞與基質(zhì)的黏附能力、體外侵襲能力和遷移能力均顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；運用pBudCE4.1-CB-CST6雙基因共表達載體進行轉(zhuǎn)染后，腫瘤細胞的基質(zhì)黏附能力、遷移能力及體外侵襲能力均受到顯著抑制，且抑制較單基因轉(zhuǎn)染組MDA/CB和MD