甜葉甙R-,1-增加C57小鼠腹側(cè)中腦及PC12細(xì)胞酪氨酸羥化酶表達(dá)的作用.pdf

1、甜葉甙R1(Suavissimoside R1，S．R1)是我室從茅莓提取物中純化出的一種三萜類化合物，我室前期研究顯示，甜葉甙R1對MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型以及MPP+誘導(dǎo)的大鼠中腦腹側(cè)多巴胺能神經(jīng)元凋亡模型除了可保護(hù)神經(jīng)元外，還可增加PD模型小鼠紋狀體DA含量，但是這些效應(yīng)的機(jī)制尚未清楚。 本課題采用正常C57小鼠及PC12細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，研究甜葉甙R1增加DA含量的可能機(jī)制。由于TH是DA合成的限速酶，我們主要研究甜葉

2、甙R1對TH表達(dá)量的影響，并初步探討甜葉甙R1提高TH表達(dá)量的細(xì)胞作用機(jī)制。 (一)甜葉甙R1對正常小鼠腹側(cè)中腦TH、p—PKC、PKC、p=PKA、PKA、p—ERK和ERK蛋白含量的作用 實(shí)驗(yàn)方法：甜葉甙R1以0.5mg/kg劑量分別給予正常小鼠口服灌胃1，3，5，10天，并設(shè)立相同天數(shù)的溶劑對照組。取小鼠腹側(cè)中腦組織，用Western blots的方法檢測TH、p—PKC、PKC、p—PKA、PKA、p—ERK和E

3、RK蛋白表達(dá)量變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：甜葉甙R1處理1，3，5和10天后，分別對TH蛋白與內(nèi)參蛋白甘油醛—3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，p—PKC與PKC、PKC與GAPDH、p—PKA與PKA、PKA與GAPDH、p—ERK和ERK、ERK和GAPDH進(jìn)行光密度值分析，將得到的比值與相應(yīng)天數(shù)溶劑對照組的比值做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)小鼠的腹側(cè)中腦TH蛋白、p—PKC、PKC、p—PKA、PKA和ERK蛋白均有所增加：TH蛋白分別增加了9％，

4、46％(P<0.05，與正常對照組比較)，100％(P<0.01，與正常對照組比較)和54％；p—PKC分別增加了6％，63％，85％(p<0.05)和10％；PKC分別增加了72％，27％，146％(p<0.05)和28％，p—PKA分別增加了10％，7％，45％(p<0.05)和18％；PKA分別增加了24％，22％，45％(p<0.05)和31％；ERK分別增加了61％，36％，51％(p<0.05)，和29％。其中處理5天的小鼠

5、腹側(cè)中腦TH、p—PKC、PKC、p—PKA、PKA和ERK增加最明顯，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。這些結(jié)果提示甜葉甙R1可以增加小鼠腹側(cè)中腦TH、p—PKC、PKC、p—PKA和PKA蛋白量。 (二)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn) 1.甜葉甙R1對NGF(50ng/mL)誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞TH蛋白表達(dá)量的作用 1.1甜葉甙R1對分化的PC12細(xì)胞TH蛋白表達(dá)的時效關(guān)系 實(shí)驗(yàn)方法：以120μM的甜時甙R1分別作用

6、分化的PC12細(xì)胞1d，2d，3d，4d，5d，6d，并設(shè)立相應(yīng)天數(shù)等體積的DMSO溶劑對照組，用Western blots的方法檢測TH蛋白表達(dá)量變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與相應(yīng)天數(shù)溶劑對照組相比，120μM甜葉甙R1作用6d時可以上調(diào)MGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞TH蛋白表達(dá)量，與對照組相比增加了20％(p<0.05)。 1.2甜時甙 R1對分純的PC12細(xì)胞硼蛋白表達(dá)的量效關(guān)系 實(shí)驗(yàn)方法：分別以20μM，60μM，1

7、20μM，240μM的甜葉甙R1作用分化的PC12細(xì)胞6d，用Western blotS的方法檢測TH蛋白表達(dá)量變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與溶劑對照組相比，60μM，120μM，240μM的甜葉甙R1處理6d，分別使PC12細(xì)胞的TH蛋白增加0.4％、19.9％(p<0.05)和11％。 2.甜葉甙R1對NGF(50ng/mL)誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞TH、p—PKC(β11)/PKC的作用 實(shí)驗(yàn)方法：120μM甜葉甙R1

8、作用分化的PC12細(xì)胞6d，用Western blots的方法檢測TH、p—PKC(β11)/PKC表達(dá)量變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與溶劑對照組相比，120μM甜葉甙R1處理6d，可使TH蛋白上調(diào)23.8％(p<0.05)，p—PKC(β11/PKC增加了9.9％(p>0.05)。 3.GF109203X拮抗甜葉甙R1增加分化的PC12細(xì)胞TH表達(dá)量的作用 實(shí)驗(yàn)方法：120μM甜葉甙R1與分化的PC12細(xì)胞孵化3天后再加

9、入特異的PKC抑制劑2μM GF109203X培養(yǎng)3天，用Western blots的方法檢測TH蛋白表達(dá)量變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與對照組相比，甜葉甙R1組TH上調(diào)23.5％(p<0.05)，GF109203X+R1組TH增加2.6％(p>0.05 vs control；p<0.05 vs S．R1)。 結(jié)論： 綜合以上結(jié)果得出：(1)甜葉甙R1可以增加正常小鼠腹側(cè)中腦TH、p—PKC、PKC、p—PKA和PKA蛋白