高血壓左心室肥大心肌細(xì)胞粘著斑激酶絲氨酸722和910磷酸化及其核轉(zhuǎn)位的研究.pdf

1、目的：在高血壓致失代償性心臟肥大的心肌細(xì)胞重建中存在粘著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的表達(dá)增加及在細(xì)胞核與膜結(jié)構(gòu)上的聚積，并且在左心室代償心肌肥大向失代償心肌重建發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)期存在FAK絲氨酸722和910的磷酸化及核聚積。在高血壓引起的左心室代償和失代償重建發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程中，是否始終存在與FAK動(dòng)態(tài)變化一致的FAK絲氨酸722和910的磷酸化及其核轉(zhuǎn)位和聚積仍需要研究。本研究通過(guò)在高血壓左心室肥大不同

2、時(shí)期大鼠動(dòng)物模型的心肌細(xì)胞中檢測(cè)FAK分子中絲氨酸722和絲氨酸910兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化及其亞細(xì)胞分布的變化，探討FAK磷酸化在高血壓致左心室肥大和心衰發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的作用。 方法： 1、研究對(duì)象：以2、6、12、18月齡的特發(fā)性高血壓心衰(spontaneously Hypertensive Heart Failure，SHHF)雄性大白鼠為研究對(duì)象，按月齡分組，每月齡組6只。以相同月齡Wister-Kyoto(WKY)雄性大白

3、鼠作為對(duì)照組，按月齡分組，每月齡組6只。2、制備組織勻漿、蛋白電泳和蛋白印跡(Western Blot，WB)方法：將左心室組織分別制成含有總蛋白、漿蛋白和核蛋白的組織勻漿，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及WB分別檢測(cè)絲氨酸722磷酸化的FAK(FAKpSer722)和絲氨酸910磷酸化的FAK(FAKpSer910)在不同月齡SHHF和WKY大白鼠左心室各種組織勻漿中的表達(dá)。3、免疫熒光標(biāo)記方法和共聚焦顯微鏡觀察：

4、對(duì)SHHF和WKY大白鼠左心室組織冰凍切片分別進(jìn)行FAKpSer722和FAKpSer910免疫熒光標(biāo)記，通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察FAKpSer722和FAKpSer910在心肌細(xì)胞中的分布及其變化。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)各月齡SHHF組的WB檢測(cè)結(jié)果與相同月齡WKY組的檢測(cè)結(jié)果分別進(jìn)行兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，不同月齡SHHF組間進(jìn)行方差分析。以P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果：WB結(jié)果顯示，F(xiàn)AKpSer7

5、22在SHHF大鼠左心室組織總蛋白中隨月齡的增長(zhǎng)而增加，各月齡SHHF組與相同月齡WKY組相比，在2月齡時(shí)無(wú)顯著性差別，在6、12和18月齡SHHF大鼠均有明顯的增加；在左心室組織核蛋白中，SHHF大鼠也是隨月齡的增長(zhǎng)而增加，各月齡SHHF組與相同月齡WKY組比較，在2月齡時(shí)無(wú)顯著性差別，在6、12和18月齡時(shí)SHHF組比WKY組均有明顯的增加；但是，在左心室組織胞漿蛋白中，SHHF組隨月齡的增長(zhǎng)反而減少，各月齡SHHF組與相同月齡WK

6、Y組比較，在2月齡時(shí)無(wú)顯著性差別，在6、12和18月齡時(shí)SHHF組比WKY組均有明顯的減少。FAKpSer910與FAKpSer722的表達(dá)結(jié)果相似，即在SHHF大鼠左心室組織總蛋白中隨月齡的增長(zhǎng)而增加，各月齡SHHF組與相同月齡WKY組相比，在2月齡時(shí)無(wú)顯著性差別，在6、12和18月齡SHHF大鼠均有明顯的增加：在左心室組織核蛋白中，SHHF大鼠也是隨月齡的增長(zhǎng)而增加，各月齡SHHF組與相同月齡WKY組比較，在2月齡時(shí)無(wú)顯著性差別，在

7、6、12和18月齡時(shí)SHHF組比WKY組均有明顯的增加；但是，在左心室組織胞漿蛋白中，SHHF組隨月齡的增長(zhǎng)反而減少，各月齡SHHF組與相同月齡WKY組比較，在2月齡時(shí)無(wú)顯著性差別，在6、12和18月齡時(shí)SHHF組比WKY組均有明顯的減少。免疫熒光標(biāo)記結(jié)果顯示，F(xiàn)AKpSer722和FAKpSer910表達(dá)均表現(xiàn)為：在2月齡時(shí)，SHHF組與WKY組的基本相似，即心肌細(xì)胞胞漿出現(xiàn)較弱的彌漫分布的綠色熒光，細(xì)胞核內(nèi)無(wú)熒光顆?；虮憩F(xiàn)為極弱的小

8、顆粒點(diǎn)狀熒光，在WKY大鼠左心室心肌細(xì)胞中這一熒光分布在6、12與18月齡均無(wú)明顯的變化，但在SHHF大鼠左心室心肌細(xì)胞中，從6月齡起卻有明顯的變化，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)的綠色熒光稍有減弱，而在細(xì)胞核內(nèi)則出現(xiàn)明亮的熒光。 結(jié)論：在高血壓性心肌失代償肥大的發(fā)生發(fā)展全過(guò)程中，存在著FAK絲氨酸722和絲氨酸910兩位點(diǎn)的磷酸化增加和核內(nèi)聚積，這一變化與高血壓致失代償心肌肥大時(shí)心肌細(xì)胞中FAK的動(dòng)態(tài)變化是一致的，提示FAK絲氨酸722和910