浙江地區(qū)豬流行性腹瀉病毒分子演化分析及其截短S1蛋白抗體制備.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）可引起豬流行性腹瀉病（Porcine epidemic diarrhea，PED），感染不同生長(zhǎng)階段豬，尤其對(duì)哺乳仔豬影響較大。自2010年以來(lái)，我國(guó)多個(gè)省份的豬場(chǎng)已大規(guī)模爆發(fā)PED，造成仔豬大量死亡。PEDV屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，5'端有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)(cap)，3'端有一個(gè)poly(A)尾，包含至少7個(gè)開(kāi)放閱

2、讀框架，編碼4個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白，分別是纖突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣殼蛋白(N);三個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白ORF1a/1b、ORF3。S基因編碼的纖突蛋白(S)是位于病毒粒子表面的糖蛋白，具有良好的免疫原性，在感染宿主體內(nèi)介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過(guò)程中發(fā)揮重要生物學(xué)作用，而輔助基因ORF3編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白與病毒的毒力及致病性有關(guān)。PEDV已然成為我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)腹瀉病的主要病原，開(kāi)展PEDV的研究刻不容緩。
　　本研究旨在:

3、(1)豬流行性腹瀉病毒RT-nPCR和熒光定量PCR檢測(cè)方法建立和應(yīng)用;(2)探明浙江及周邊地區(qū)豬流行性腹瀉病毒S和ORF3基因的分子演化特征;(3)制備截短流行株P(guān)EDV S1蛋白多克隆抗體。
　　1.本研究建立了針對(duì)PEDV的RT-nPCR和熒光定量PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，建立的PEDV RT-nPCR的檢測(cè)下限為2×10-5pg/μL的模版cDNA，且具有較好的特異性;基于SYBR GreenⅠ的Real-time PCR

4、檢測(cè)方法敏感性為2.3×101copies/μL的模版cDNA。在2013年4月至2015年1月間，浙江省周邊地區(qū)的8個(gè)地市，25家規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)的159份病料PEDV陽(yáng)性率為49.7％(79/159)。
　　2.分離獲得了PEDV CV777疫苗株。結(jié)果顯示，在Vero細(xì)胞培養(yǎng)基中加入3μg/mL胰酶，可進(jìn)行來(lái)源于三聯(lián)四價(jià)的弱毒疫苗(PEDV-TGEV-PRV)中CV777的分離培養(yǎng)。Vero細(xì)胞感染CV77736 h-48 h后

5、，可形成合胞體和細(xì)胞圓縮等明顯的細(xì)胞病變。對(duì)CV777不同代次RT-nPCR、測(cè)序分析、電鏡(Electronmicroscope，EM)和間接免疫熒光(Indirect immunofluorescence，IFA)檢測(cè)分析表明，分離培養(yǎng)的為PEDV CV777毒株。
　　3.研究選取PEDV感染嚴(yán)重、死亡率較高的6個(gè)豬場(chǎng)6株P(guān)EDV臨床株進(jìn)行S和ORF3基因全長(zhǎng)克隆分析。6株P(guān)EDV分離株屬于第Ⅲ群，與第Ⅰ群的CV777、SM

6、98存在較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系;6株臨床株的S、S1和S2基因與國(guó)內(nèi)外參考毒株的同源性分別為93.8％-99.6％、91.7％-99.7％和96.2％-99.7％，氨基酸相似性分別為92.4％-99.7％、89.9％-99.7％和96.2％-100.0％;選取其中變異性較大的S1序列與經(jīng)典毒株CV777、SM98、attDR13、virDR13進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)臨床株在第58位至61位插入NQGV、在136位插入N、在225位堿基由E突變?yōu)镼等;N

7、-糖基化位點(diǎn)分析，ZJ14NB0301，ZJ13LY1201以及ZJ13XS0401流行株存在28個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，而SH131202，ZJ14HZ0301以及ZJ13SX1101與疫苗株CV777一樣含有29個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，但存在位置的差異。6株P(guān)EDV臨床株的ORF3序列與參考毒株氨基酸同源性及核苷酸相似性分別為92.8％-100％、92.4％-100.0％，與致弱突變型attDR13的ORF3基因相比，存在部分片段的插入。

8、>　　4.研究成功構(gòu)建了3個(gè)截短流行株P(guān)EDV(ZJ13SX1101) S1蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒，并獲得了重組融合的His-S1T1(47-394aa)、His-S1T2(233-741aa)和MBP-S1T2(233-741aa)原核表達(dá)蛋白，以上述純化的原核表達(dá)蛋白為抗原，分別制備了兔抗His-S1T1抗體、兔抗His-S1T2抗體和兔抗His-S1T1+His-S1T2抗體。以建立的MBP-S1T2為包被抗原的ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示

9、，兔抗His-S1T1抗體、兔抗His-S1T2和兔抗His-S1T1+ His-S1T2抗體效價(jià)分別為1∶6400、1∶3200和1∶12800。3個(gè)多克隆抗體經(jīng)Western blot分析，均可與MBP-S1T2反應(yīng);經(jīng)IFA分析，只有針對(duì)S1T1片段的抗體與CV777具有一定的反應(yīng)性，但反應(yīng)性較弱。
　　上述研究結(jié)果為開(kāi)展PEDV分子檢測(cè)、探明其分子演化特征提供了方法和數(shù)據(jù)，獲得的抗流行株P(guān)EDV-S1多抗為下一步開(kāi)展研究提