絲氨酸蛋白酶對豬流行性腹瀉病毒S蛋白的作用及其對病毒繁殖的影響.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，以各年齡豬嘔吐、腹瀉、脫水為特征的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。PED的暴發(fā)及流行給我國和世界養(yǎng)豬國家造成了巨大的經(jīng)濟損失，現(xiàn)已成為仔豬早期死亡的重要疫病之一。近年來，有報道稱即使疫苗免疫過的豬群仍可感染PEDV，疫苗免疫效果的下降可能是由于PEDV流行毒株的變

2、異導(dǎo)致的。因此探索PEDV感染的發(fā)生、發(fā)展機制，建立有效的分離培養(yǎng)方法，研發(fā)特效的新型藥物和高效的疫苗制品是各國學(xué)者關(guān)注并亟待解決的問題。而在實踐中，PEDV新流行毒株的分離培養(yǎng)難度大，細胞繁殖滴度低是制約對該病毒深入研究的重要障礙。
　　近年來，有報道發(fā)現(xiàn)一些宿主蛋白酶，其中包括Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶(typeⅡtransmembrane serine protease，TTSP)家族中的幾個成員，具有類似胰酶的催化活性，可以裂解

3、活化流感病毒及一些冠狀病毒囊膜蛋白，在沒有胰酶的條件下促進病毒侵入宿主細胞進行繁殖復(fù)制，但是對于同是需要胰酶培養(yǎng)的PEDV繁殖影響的研究卻并不深入。本研究選取TTSP家族中跨膜絲氨酸蛋白酶2（transmembrane protease serine2，TMPRSS2）、呼吸道胰酶樣蛋白酶（human airway trypsin-like protease，HAT）、鱗癌細胞差異表達蛋白酶1（differentially expres

4、sed squamous cell carcinoma gene1，DESC1）和鑲嵌式長型絲氨酸蛋白酶(mosaic serine protease large-form，MSPL)進行研究，分析其對PEDV繁殖的影響，并進一步深入機理探究其對S蛋白的作用。由于PEDV體外連續(xù)傳代可能會失去對胰酶的依賴性，因此本研究首先確認實驗室保存的PEDV分離株LJB/03低代次(P23)和高代次(P146)細胞培養(yǎng)毒對胰酶的依賴性。通過接毒病變

5、情況，結(jié)合熒光定量PCR及S蛋白序列比對分析，結(jié)果表明LJB/03 P23具有胰酶依賴性，而LJB/03 P146在添加胰酶和不添加胰酶的條件下繁毒效果差異不大，具有胰酶不完全依賴性。通過PEDV S蛋白氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，LJB/03 P146部分突變和缺失的氨基酸殘基與其他弱毒株突變位點一致，說明LJB/03 P146經(jīng)過連續(xù)傳代可能有弱化的趨勢。
　　為了探究TTSPs對PEDV繁殖的影響，分別選取PEDV LJB/03 P

6、23和P146作為研究對象，分析TMPRSS2、HAT、DESC1和MSPL對依賴胰酶和不完全依賴胰酶的PEDV毒株在Vero細胞上復(fù)制的作用。結(jié)果表明，TMPRSS2和MSPL有效促進具有胰酶依賴性的PEDVLJB/03 P23毒株在不添加胰酶的Vero細胞上的繁殖，并提高病毒滴度，其中MSPL促進效果最為顯著，甚至優(yōu)于3μg/mL胰酶的作用，HAT和DESC1則沒有顯著的促進效果。而不完全依賴胰酶的LJB/03 P146對TTSPs

7、和胰酶均不敏感。為評價TTSPs是否有助于PEDV流行毒株的體外分離培養(yǎng)，將感染PEDV的仔豬小腸組織進行處理，分別接種于瞬時表達TMPRSS2、HAT、DESC1和MSPL的Vero細胞，并與胰酶組進行對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEDV分離毒株在表達TMPRSS2和MSPL的Vero細胞上可以穩(wěn)定傳代，并且繁殖效果要優(yōu)于HAT、DESC1和添加胰酶組。
　　通過TTSPs對PEDV在Vero細胞上繁殖促進作用的初步探索，結(jié)果顯示PEDV在V

8、ero細胞上繁殖對TMPRSS2和MSPL具有計量依賴性，而HAT和DESC1對PEDV無激活活性。利用哺乳動物雙雜交系統(tǒng)結(jié)合雙熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn)，TMPRSS2和MSPL有效促進感染LJB/03 P23的Vero細胞膜融合，其中MSPL優(yōu)于1μg/mL胰酶作用效果;而TTSPs對LJB/03 P146的促細胞膜融合效果并不顯著。為了研究TTSPs是否有助于PEDV病毒粒子侵入，并從反面驗證TTSPs對PEDV的復(fù)制有促進作用，采用TTS

9、P的抑制劑AEBSF-HCl與依賴胰酶特性的LJB/03 P23進行研究。結(jié)果顯示，AEBSF-HCl具有顯著抑制TTSPs活性，從而使PEDV在表達TTSPs的Vero細胞上的繁殖抑制效果呈劑量依賴性，病毒mRNA水平隨抑制劑濃度增高而降低。為進一步驗證TTSPs與PEDV LJB/03 P23、P146的相互作用，利用激光共聚焦試驗分析二者在細胞的定位情況。結(jié)果顯示，LJB/03 P23、P146與TMPRSS2和MSPL產(chǎn)生良好的

10、共定位效果，而與HAT和DESC1并未觀察到共定位現(xiàn)象。
　　為了深入探究TMPRSS2和MSPL促進PEDV在宿主細胞中復(fù)制的機理，分別構(gòu)建了PEDV LJB/03親本株和P146毒株的S蛋白真核表達質(zhì)粒，研究TTSPs對PEDV依賴胰酶的親本株和不完全依賴胰酶的適應(yīng)細胞株S蛋白的作用。胰酶對S蛋白裂解性試驗結(jié)果顯示，與18μg/mL胰酶作用后的S蛋白于150 kDa左右均有一條特異性的裂解條帶，且S蛋白的全長條帶亮度明顯減弱。

11、該結(jié)果證實胰酶識別S蛋白的裂解位點在S2區(qū)的890位氨基酸，其裂解活性可以促進病毒與宿主細胞膜融合，利于病毒粒子的侵入。為了研究TTSPs對PEDV S蛋白的裂解作用，分別將TTSPs與S蛋白真核表達質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示TMPRSS2和MSPL均可以將PEDV親本株和適應(yīng)細胞株的S蛋白裂解，產(chǎn)生約35 kDa的裂解條帶，而HAT和DESC1并未檢測到對S蛋白的裂解。分析TMPRSS2和MSPL可能識別裂解S1區(qū)域，該區(qū)域氨基酸具有P

12、EDV受體結(jié)合區(qū)及識別輔助糖受體的功能。與胰酶的裂解作用不同的是，TMPRSS2和MSPL對S蛋白的裂解可能暴露PEDV纖突蛋白與宿主細胞受體結(jié)合區(qū)，使病毒粒子更易于與細胞受體結(jié)合，促進病毒侵入從而增強PEDV感染細胞的能力。通過激光共聚焦技術(shù)證實了TMPRSS2和MSPL可以與S蛋白之間發(fā)生相互作用。利用PED V S蛋白包裝的假病毒模擬病毒粒子，進一步驗證TTSPs在病毒侵入階段是否有促進作用。結(jié)果顯示TMPRSS2和MSPL有效促

13、進PEDV親本株S蛋白包裝的假病毒侵入細胞，而這種激活作用很可能與絲氨酸蛋白酶對S蛋白的裂解活化作用有關(guān)。利用哺乳動物雙雜交系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，TMPRSS2和MSPL不但激活親本株的S蛋白，還對不完全依賴胰酶的適應(yīng)細胞株的S蛋白具有激活效果，促進細胞膜的融合。通過對仔豬小腸組織TTSPs表達水平的檢測，結(jié)果顯示四種TTSPs均有表達;而在感染PEDV的小腸組織上，TTSPs相對表達水平均略有增高，這可能是PEDV為了在體內(nèi)更好的感染和復(fù)

14、制，誘導(dǎo)機體上調(diào)表達TTSPs的結(jié)果。
　　綜上所述，本研究篩選出TMPRSS2和MSPL可有效促進有胰酶依賴性的PEDV在不添加胰酶的Vero細胞上的復(fù)制，并進一步證實TMPRSS2和MSPL對S蛋白具有裂解催化活性，可以激活病毒粒子侵入宿主細胞、促進膜融合從而利于病毒的繁殖復(fù)制。本研究揭示了TTSPs與PEDVS蛋白互作的分子機制及其對PEDV復(fù)制的影響，為提高病毒繁殖滴度、擴大病毒產(chǎn)量、提高流行毒株體外培養(yǎng)適應(yīng)性提供新的思路