絲氨酸蛋白酶對(duì)豬流行性腹瀉病毒S蛋白的作用及其對(duì)病毒繁殖的影響.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，以各年齡豬嘔吐、腹瀉、脫水為特征的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。PED的暴發(fā)及流行給我國(guó)和世界養(yǎng)豬國(guó)家造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，現(xiàn)已成為仔豬早期死亡的重要疫病之一。近年來(lái)，有報(bào)道稱即使疫苗免疫過(guò)的豬群仍可感染PEDV，疫苗免疫效果的下降可能是由于PEDV流行毒株的變

2、異導(dǎo)致的。因此探索PEDV感染的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，建立有效的分離培養(yǎng)方法，研發(fā)特效的新型藥物和高效的疫苗制品是各國(guó)學(xué)者關(guān)注并亟待解決的問(wèn)題。而在實(shí)踐中，PEDV新流行毒株的分離培養(yǎng)難度大，細(xì)胞繁殖滴度低是制約對(duì)該病毒深入研究的重要障礙。
　　近年來(lái)，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)一些宿主蛋白酶，其中包括Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶(typeⅡtransmembrane serine protease，TTSP)家族中的幾個(gè)成員，具有類似胰酶的催化活性，可以裂解

3、活化流感病毒及一些冠狀病毒囊膜蛋白，在沒(méi)有胰酶的條件下促進(jìn)病毒侵入宿主細(xì)胞進(jìn)行繁殖復(fù)制，但是對(duì)于同是需要胰酶培養(yǎng)的PEDV繁殖影響的研究卻并不深入。本研究選取TTSP家族中跨膜絲氨酸蛋白酶2（transmembrane protease serine2，TMPRSS2）、呼吸道胰酶樣蛋白酶（human airway trypsin-like protease，HAT）、鱗癌細(xì)胞差異表達(dá)蛋白酶1（differentially expres

4、sed squamous cell carcinoma gene1，DESC1）和鑲嵌式長(zhǎng)型絲氨酸蛋白酶(mosaic serine protease large-form，MSPL)進(jìn)行研究，分析其對(duì)PEDV繁殖的影響，并進(jìn)一步深入機(jī)理探究其對(duì)S蛋白的作用。由于PEDV體外連續(xù)傳代可能會(huì)失去對(duì)胰酶的依賴性，因此本研究首先確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室保存的PEDV分離株LJB/03低代次(P23)和高代次(P146)細(xì)胞培養(yǎng)毒對(duì)胰酶的依賴性。通過(guò)接毒病變

5、情況，結(jié)合熒光定量PCR及S蛋白序列比對(duì)分析，結(jié)果表明LJB/03 P23具有胰酶依賴性，而LJB/03 P146在添加胰酶和不添加胰酶的條件下繁毒效果差異不大，具有胰酶不完全依賴性。通過(guò)PEDV S蛋白氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，LJB/03 P146部分突變和缺失的氨基酸殘基與其他弱毒株突變位點(diǎn)一致，說(shuō)明LJB/03 P146經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代可能有弱化的趨勢(shì)。
　　為了探究TTSPs對(duì)PEDV繁殖的影響，分別選取PEDV LJB/03 P

6、23和P146作為研究對(duì)象，分析TMPRSS2、HAT、DESC1和MSPL對(duì)依賴胰酶和不完全依賴胰酶的PEDV毒株在Vero細(xì)胞上復(fù)制的作用。結(jié)果表明，TMPRSS2和MSPL有效促進(jìn)具有胰酶依賴性的PEDVLJB/03 P23毒株在不添加胰酶的Vero細(xì)胞上的繁殖，并提高病毒滴度，其中MSPL促進(jìn)效果最為顯著，甚至優(yōu)于3μg/mL胰酶的作用，HAT和DESC1則沒(méi)有顯著的促進(jìn)效果。而不完全依賴胰酶的LJB/03 P146對(duì)TTSPs

7、和胰酶均不敏感。為評(píng)價(jià)TTSPs是否有助于PEDV流行毒株的體外分離培養(yǎng)，將感染PEDV的仔豬小腸組織進(jìn)行處理，分別接種于瞬時(shí)表達(dá)TMPRSS2、HAT、DESC1和MSPL的Vero細(xì)胞，并與胰酶組進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEDV分離毒株在表達(dá)TMPRSS2和MSPL的Vero細(xì)胞上可以穩(wěn)定傳代，并且繁殖效果要優(yōu)于HAT、DESC1和添加胰酶組。
　　通過(guò)TTSPs對(duì)PEDV在Vero細(xì)胞上繁殖促進(jìn)作用的初步探索，結(jié)果顯示PEDV在V

8、ero細(xì)胞上繁殖對(duì)TMPRSS2和MSPL具有計(jì)量依賴性，而HAT和DESC1對(duì)PEDV無(wú)激活活性。利用哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)結(jié)合雙熒光素酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TMPRSS2和MSPL有效促進(jìn)感染LJB/03 P23的Vero細(xì)胞膜融合，其中MSPL優(yōu)于1μg/mL胰酶作用效果;而TTSPs對(duì)LJB/03 P146的促細(xì)胞膜融合效果并不顯著。為了研究TTSPs是否有助于PEDV病毒粒子侵入，并從反面驗(yàn)證TTSPs對(duì)PEDV的復(fù)制有促進(jìn)作用，采用TTS

9、P的抑制劑AEBSF-HCl與依賴胰酶特性的LJB/03 P23進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，AEBSF-HCl具有顯著抑制TTSPs活性，從而使PEDV在表達(dá)TTSPs的Vero細(xì)胞上的繁殖抑制效果呈劑量依賴性，病毒mRNA水平隨抑制劑濃度增高而降低。為進(jìn)一步驗(yàn)證TTSPs與PEDV LJB/03 P23、P146的相互作用，利用激光共聚焦試驗(yàn)分析二者在細(xì)胞的定位情況。結(jié)果顯示，LJB/03 P23、P146與TMPRSS2和MSPL產(chǎn)生良好的

10、共定位效果，而與HAT和DESC1并未觀察到共定位現(xiàn)象。
　　為了深入探究TMPRSS2和MSPL促進(jìn)PEDV在宿主細(xì)胞中復(fù)制的機(jī)理，分別構(gòu)建了PEDV LJB/03親本株和P146毒株的S蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒，研究TTSPs對(duì)PEDV依賴胰酶的親本株和不完全依賴胰酶的適應(yīng)細(xì)胞株S蛋白的作用。胰酶對(duì)S蛋白裂解性試驗(yàn)結(jié)果顯示，與18μg/mL胰酶作用后的S蛋白于150 kDa左右均有一條特異性的裂解條帶，且S蛋白的全長(zhǎng)條帶亮度明顯減弱。

11、該結(jié)果證實(shí)胰酶識(shí)別S蛋白的裂解位點(diǎn)在S2區(qū)的890位氨基酸，其裂解活性可以促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞膜融合，利于病毒粒子的侵入。為了研究TTSPs對(duì)PEDV S蛋白的裂解作用，分別將TTSPs與S蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示TMPRSS2和MSPL均可以將PEDV親本株和適應(yīng)細(xì)胞株的S蛋白裂解，產(chǎn)生約35 kDa的裂解條帶，而HAT和DESC1并未檢測(cè)到對(duì)S蛋白的裂解。分析TMPRSS2和MSPL可能識(shí)別裂解S1區(qū)域，該區(qū)域氨基酸具有P

12、EDV受體結(jié)合區(qū)及識(shí)別輔助糖受體的功能。與胰酶的裂解作用不同的是，TMPRSS2和MSPL對(duì)S蛋白的裂解可能暴露PEDV纖突蛋白與宿主細(xì)胞受體結(jié)合區(qū)，使病毒粒子更易于與細(xì)胞受體結(jié)合，促進(jìn)病毒侵入從而增強(qiáng)PEDV感染細(xì)胞的能力。通過(guò)激光共聚焦技術(shù)證實(shí)了TMPRSS2和MSPL可以與S蛋白之間發(fā)生相互作用。利用PED V S蛋白包裝的假病毒模擬病毒粒子，進(jìn)一步驗(yàn)證TTSPs在病毒侵入階段是否有促進(jìn)作用。結(jié)果顯示TMPRSS2和MSPL有效促

13、進(jìn)PEDV親本株S蛋白包裝的假病毒侵入細(xì)胞，而這種激活作用很可能與絲氨酸蛋白酶對(duì)S蛋白的裂解活化作用有關(guān)。利用哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，TMPRSS2和MSPL不但激活親本株的S蛋白，還對(duì)不完全依賴胰酶的適應(yīng)細(xì)胞株的S蛋白具有激活效果，促進(jìn)細(xì)胞膜的融合。通過(guò)對(duì)仔豬小腸組織TTSPs表達(dá)水平的檢測(cè)，結(jié)果顯示四種TTSPs均有表達(dá);而在感染PEDV的小腸組織上，TTSPs相對(duì)表達(dá)水平均略有增高，這可能是PEDV為了在體內(nèi)更好的感染和復(fù)

14、制，誘導(dǎo)機(jī)體上調(diào)表達(dá)TTSPs的結(jié)果。
　　綜上所述，本研究篩選出TMPRSS2和MSPL可有效促進(jìn)有胰酶依賴性的PEDV在不添加胰酶的Vero細(xì)胞上的復(fù)制，并進(jìn)一步證實(shí)TMPRSS2和MSPL對(duì)S蛋白具有裂解催化活性，可以激活病毒粒子侵入宿主細(xì)胞、促進(jìn)膜融合從而利于病毒的繁殖復(fù)制。本研究揭示了TTSPs與PEDVS蛋白互作的分子機(jī)制及其對(duì)PEDV復(fù)制的影響，為提高病毒繁殖滴度、擴(kuò)大病毒產(chǎn)量、提高流行毒株體外培養(yǎng)適應(yīng)性提供新的思路