基于NASBA技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌耐藥性方法的建立.pdf

1、目的：產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌在世界各地的爆發(fā)威脅著人類的生命健康，而且攜帶KPC的細(xì)菌感染與高死亡率呈正相關(guān)。因此及時(shí)準(zhǔn)確快速的檢出產(chǎn) KPC細(xì)菌對(duì)預(yù)防、控制耐藥菌株的流行意義重大。推薦的改良Hodge試驗(yàn)準(zhǔn)確性高，但較費(fèi)時(shí)。PCR擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)間大大縮短，但對(duì)儀器設(shè)備和場(chǎng)所要求較高。核酸序列依賴性擴(kuò)增NASBA具有操作簡(jiǎn)便、擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。本研究旨在建立檢測(cè)KPC耐藥的NASBA檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
　

2、　方法：本實(shí)驗(yàn)采用依賴KPC轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的NASBA擴(kuò)增檢測(cè)KPC耐藥。根據(jù)Genebank中肺炎克雷伯菌管家基因MDH的保守序列、腸桿菌科細(xì)菌耐藥基因KPC的保守序列設(shè)計(jì)NASBA引物，將上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序鑒定。同時(shí)摸索及優(yōu)化NASBA反應(yīng)中各酶濃度、離子濃度、反應(yīng)溫度等條件，分析該方法的靈敏度和特異性。采用該NASBA方法、PCR及逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)臨床收集的45株肺炎克雷伯菌，比較結(jié)果的一致性。
　　結(jié)果

3、：KPC及MDH的NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分別得到249 n t、190nt的特異性條帶，并且測(cè)序鑒定序列與預(yù)計(jì)片段序列比對(duì)一致。通過(guò)摸索及優(yōu)化NASBA反應(yīng)中各酶濃度、離子濃度、反應(yīng)溫度等條件建立NASBA擴(kuò)增體系（24μl）：緩沖液中氯化鉀終濃度60mmol/L，氯化鎂終濃度14mmol/L，PH8.0 Tris-HCl終濃度40mmol/L，DTT終濃度7.5mmol/L，DMSO終濃度15％；每個(gè)引物終濃度0.2μm

4、ol/L；d N T P1mmol/L；N T P2mmol/L；酶混合液中T7 R N A聚合酶50 U、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶10U、RNase H0.5U、BSA0.1mg/ml；反應(yīng)溫度：40℃；反應(yīng)時(shí)間：90min。該NASBA方法能檢測(cè)到10-3ng/μl的RNA量，較RT-PCR方法多2個(gè)數(shù)量級(jí)，提示該方法比RT-PCR靈敏度高；對(duì)照KPC陰性菌株與KPC陽(yáng)性菌株的NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析發(fā)現(xiàn)僅KPC陽(yáng)性菌株出現(xiàn)特異性條帶。45