煙草叢頂病毒RdRp介導的體外復制調(diào)控研究.pdf

1、煙草叢頂病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）為番茄叢矮病毒科（Tombusviridae）幽影病毒屬（Umbravirus）成員，與黃癥病毒科（Luteoviridae）的煙草扭脈病毒（Tobacco vein distorting virus, TVDV）復合侵染引起煙草叢頂病。TBTV基因組是一條（+）ssRNA，由4152個核苷酸組成，編碼4個開放閱讀框。ORF1編碼35 kDa的蛋白，ORF1的C端與

2、ORF2的N端有8個密碼子的重疊，ORF1蛋白通過-1位的移碼翻譯機制表達產(chǎn)生RdRp，為ORF1/ORF2融合蛋白形式。在對云南多地采集的煙草叢頂病毒進化分析后發(fā)現(xiàn)，煙草叢頂病毒RdRp編碼區(qū)序列一致率相對較低，推測RdRp的活性變化可能導致病毒致病力的變化。
　　本研究旨在建立 TBTV RdRp介導的體外復制體系，并初步定位參與復制調(diào)控的RNA元件。首先通過重疊PCR擴增得到煙草叢頂病毒中國分離物RdRp的編碼序列。構建以p

3、MAL-C2X為基礎載體的原核表達載體pMAL-TB-RdRp。0.5 mM IPTG誘導可特異性表達分子量約為120 kDa的 MBP-RdRp融合蛋白。不同溫度條件下誘導MBP-RdRp，結果顯示，相比26℃和37℃，18℃下誘導表達的MBP-RdRp融合蛋白的可溶性比例較高，約17％；經(jīng)親和層析純化的MBP-RdRp可特異性識別TBTV正鏈和負鏈的3'末端序列，催化體外復制；并且對正負鏈的3'末端的體外復制效率存在差別，識別負鏈3

4、'末端的體外復制效率明顯高于正鏈3'末端。說明TBTV RdRp介導的特異性體外復制的建立。同時，結合RNA結構體外分析構建了3'UTR區(qū)的部分突變體，根據(jù)體外復制效率的變化初步定位了參與復制調(diào)控的RNA元件。
　　同時，構建了不同分離物TB-JC，TB-MDI，TB-MDII的RdRp的原核表達載體，并初步驗證了純化的不同分離物RdRp的體外復制活性。為將來進行不同TBTV分離物RdRp的活性比較并定位關鍵氨基酸突變奠定了基礎。