人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)嚴(yán)重?zé)齻笫髣?chuàng)面愈合及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　燒傷是平時(shí)、戰(zhàn)時(shí)的常見外傷,突發(fā)性成批燒傷的救治效果與維護(hù)社會穩(wěn)定密切相關(guān)。挽救嚴(yán)重?zé)齻颊呱年P(guān)鍵環(huán)節(jié)是盡早封閉創(chuàng)面。近些年的研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)能夠有效修復(fù)損傷組織器官的結(jié)構(gòu)和功能?；贛SCs有效修復(fù)重建損傷組織器官的功能,本研究擬探討MSCs對嚴(yán)重?zé)齻麆?chuàng)面的修復(fù)潛能。因此,將分離培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human Umbilical Cord Mes

2、enchymal Stem Cells,hUCMSCs)移植入嚴(yán)重?zé)齻笫篌w內(nèi),探討 hUCMSCs對嚴(yán)重?zé)齻笫髣?chuàng)面愈合的調(diào)控作用及機(jī)制,從而為臨床嚴(yán)重?zé)齻麆?chuàng)面的治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　(1)采用3種酶消化法(單純膠原酶Ⅱ消化法、膠原酶Ⅱ+胰蛋白酶消化法、膠原酶Ⅱ+透明質(zhì)酸酶消化法)及組織塊貼壁法分離培養(yǎng) hUCMSCs。免疫熒光染色法/流式鑒定細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD105、CD90、CD44、CD73

3、、HLA-I、CD45、HLA-DR、CD31和vWF;油紅O染色、阿利新藍(lán)染色和Von Kossa鈣沉積法鑒定細(xì)胞成脂、成軟骨和成骨的分化潛能;倒置相差顯微鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu);MTT法檢測不同代細(xì)胞的增殖情況以及hUCMSCs對T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用;碘化丙啶(PI)染色和流式檢測不同代 hUCMSCs的細(xì)胞周期。
　　(2)收集特重度燒傷患者血清和正常對照血清。使用10％胎牛血清(10% FBS)、10%正常對照血

4、清(10%HCS)和10%燒傷3d患者血清(10%BPS3d)培養(yǎng)體系培養(yǎng)hUCMSCs。AO-EB染色法/流式檢測三組細(xì)胞的凋亡情況;倒置相差顯微鏡觀察三組細(xì)胞的生長密度;MTT法檢測三組細(xì)胞的增殖情況;碘化丙啶(PI)染色和流式檢測三組的細(xì)胞周期;β-gal染色檢測三組細(xì)胞的衰老情況。
　　(3)取成年雄性Wistar大鼠126只,隨機(jī)分成假傷組,燒傷組和燒傷+hUCMSCs移植組。將GFP標(biāo)記的hUCMSCs或PBS通過尾靜

5、脈注入對應(yīng)組大鼠體內(nèi)。Image Pro Plus軟件評估大鼠創(chuàng)面的愈合率;小動物活體熒光成像系統(tǒng)(BLI)檢測GFP-hUCMSCs在大鼠體內(nèi)的遷移情況;PCR技術(shù)檢測創(chuàng)面是否表達(dá)人類特異性DNA;免疫組化染色檢測創(chuàng)面炎癥細(xì)胞浸潤程度、新生微血管數(shù)量以及I、III型膠原表達(dá);激光多普勒血流儀評估創(chuàng)面的血流;ELISA法檢測創(chuàng)面促炎因子、抗炎因子、VEGF、I型膠原、III型膠原的含量。
　　(4)實(shí)驗(yàn)分為3組:10%正常對照血清

6、(10%HCS)、10%燒傷3d患者血清(10% BPS3d)和10%燒傷3d患者血清+Notch信號特異性抑制劑 DAPT/GSI(DAPT/GSI+BPS)或者分為5組:10% HCS、10% BPS3d、10%HCS+20ng/mL VEGF、10% HCS+20ng/mL bFGF和10% HCS+20ng/mL VEGF+20ng/mL bFGF培養(yǎng)hUCMSCs。MTT法和臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)檢測 hUCMSCs的存活和增殖情況;

7、 PI染色和流式檢測細(xì)胞的增殖周期;Western Blot檢測周期蛋白D(Cyclin D)的表達(dá)情況;ELISA法檢測血清中VEGF、bFGF等細(xì)胞因子的含量;免疫熒光染色法檢測VEGFR1和bFGFR2的表達(dá)情況;Western Blot和qRT-PCR檢測Notch信號關(guān)鍵分子Notch-1和Hes-1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　(1)四種方法均可獲得hUCMSCs,但膠原酶Ⅱ+透明質(zhì)酸酶消化法獲得細(xì)胞數(shù)量較多,且

8、獲得細(xì)胞的增殖速率較快。因此,膠原酶Ⅱ+透明質(zhì)酸酶消化法是一種高效提取hUCMSCs的方法。獲得的細(xì)胞陽性表達(dá)間質(zhì)系表面標(biāo)志物,但不表達(dá)內(nèi)皮系和造血系表面標(biāo)志物。傳代到3代時(shí),細(xì)胞的形態(tài)為長梭形,呈旋渦狀生長。透射電鏡示該細(xì)胞的核大且不規(guī)則,核仁明顯,胞漿較少。使用特定誘導(dǎo)液誘導(dǎo),其可向脂肪細(xì)胞、成軟骨和成骨細(xì)胞分化。細(xì)胞周期的結(jié)果顯示,80%以上的細(xì)胞處于靜止期(G0~G1期),符合較原始干細(xì)胞的特征。綜合以上結(jié)果確定分離得到的細(xì)胞是

9、hUCMSCs。MTT的結(jié)果示,各代的hUCMSCs經(jīng)1d潛伏期,2d-6d是對數(shù)增殖期,于第7d時(shí)開始出現(xiàn)不同程度的接觸抑制而進(jìn)入平臺期。此外,hUCMSCs能顯著抑制由植物血凝素(PHA)誘導(dǎo)同種異體T細(xì)胞的增殖。
　　(2)10%FBS、10%HCS和10%BPS3d培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUCMSCs形態(tài)和結(jié)構(gòu)均正常,未見細(xì)胞核著橘紅色熒光的凋亡細(xì)胞或死亡細(xì)胞;流式的結(jié)果也驗(yàn)證了此結(jié)果。MTT的結(jié)果示,從第2d至第6d,10% B

10、PS3d組細(xì)胞的增殖速度和增殖細(xì)胞量顯著快于和多于其它兩組;倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞增殖生長的融合結(jié)果同 MTT。10%BPS3d組細(xì)胞增殖期(S)的比例顯著高于其它兩組,而衰老細(xì)胞的百分率則顯著低于其他兩組。綜上所述,嚴(yán)重?zé)齻逯泻幸恍┍Ｗo(hù)細(xì)胞且促進(jìn)細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子,因此將 hUCMSCs移植治療嚴(yán)重?zé)齻麆游锬Ｐ褪强尚械摹?br>　　(3)將GFP-hUCMSCs靜脈移植入嚴(yán)重?zé)齻笫篌w內(nèi),其可隨著血液循環(huán)遷移到達(dá)燒傷創(chuàng)面,顯著降

11、低創(chuàng)面炎癥細(xì)胞浸潤程度、顯著降低創(chuàng)面促炎因子IL-1,IL-6,TNF-α水平和顯著增加抗炎因子 IL-10和 TNF-α的刺激基因-6(TSG-6)水平。此外, hUCMSCs還可顯著增加創(chuàng)面新生微血管的數(shù)量和VEGF水平以及顯著上調(diào)創(chuàng)面中I型膠原、III型膠原比例,進(jìn)而加速了嚴(yán)重?zé)齻麆?chuàng)面的愈合過程。
　　(4)與10% HCS相比,10%BPS3d可顯著促進(jìn)hUCMSCs快速增殖和顯著促進(jìn)hUCMSCs的細(xì)胞周期從靜止期進(jìn)入了

12、增殖期,也可顯著升高Cyclin D的表達(dá)水平以及可顯著升高Notch信號關(guān)鍵分子Notch-1和Hes-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平,而給予Notch信號特異性抑制劑DAPT/GSI后,則可顯著降低10%BPS3d誘導(dǎo)的hUCMSCs增殖和顯著降低Notch-1和Hes-1的表達(dá)水平。BPS中VEGF和bFGF的含量顯著高于其它細(xì)胞因子,且hUCMSCs表達(dá)了VEGF和bFGF的受體。分別應(yīng)用以及聯(lián)合應(yīng)用VEGF和bFGF的抗體,發(fā)現(xiàn)

13、聯(lián)合應(yīng)用二者的抗體可以顯著降低由10% BPS3d誘導(dǎo)hUCMSCs的增殖,相反添加外源性聯(lián)bFGF和VEGF可顯著誘導(dǎo)hUCMSCs的增殖和顯著上調(diào)Notch-1和Hes-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。說明嚴(yán)重?zé)齻逯械腷FGF和VEGF是促進(jìn)hUCMSCs的關(guān)鍵因子。
　　結(jié)論:
　　hUCMSCs能顯著加速嚴(yán)重?zé)齻笫髣?chuàng)面的愈合。其次是嚴(yán)重?zé)齻颊哐逯衎FGF和VEGF激活了Notch信號通路進(jìn)而促進(jìn)hUCMSCs