腺病毒介導(dǎo)GRIM19誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化及相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗研究.pdf

1、背景與目的: 膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤。盡管近年來在手術(shù)、放療、化療等方面已取得很大進(jìn)展，但其療效仍不容樂觀。目前膠質(zhì)瘤的診斷、治療取得了一定進(jìn)展，根本上未改變這一致命腫瘤的自然轉(zhuǎn)歸，因而探索新的治療方法顯得十分迫切和必要。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的快速發(fā)展，生物治療新的治療方法包括基因治療、誘導(dǎo)分化治療為惡性膠質(zhì)瘤治療帶來了希望。 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的失控常會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。其中作為轉(zhuǎn)錄因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激

2、活因子3（signal transducers and activators of transcription3，STAT3）的異常表達(dá)與活化pSTAT3常常見于各種膠質(zhì)瘤。異?；罨腟TAT3分子對維持膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展是必要的，可以促進(jìn)許多抗凋亡與促腫瘤細(xì)胞增殖基因的非正常轉(zhuǎn)錄，從而使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。GRIM19（the genes-associated with retinoid-interferon induced mort

3、ality19）是一種由維甲酸（retinoic acid，RA）與干擾素β（interferonβ，IFN-β）聯(lián)合誘導(dǎo)的一種細(xì)胞死亡調(diào)控基因，其在許多腫瘤中具有促凋亡功能。近來發(fā)現(xiàn)GRIM19作為一種腫瘤抑制分子，可抑制由STAT3組成性活化誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化；并在膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)分化的過程中顯著上調(diào)。在本研究中，我們構(gòu)建、包裝與純化了攜帶人GRIM19基因的重組復(fù)制缺陷型的腺病毒，觀察其介導(dǎo)人GRIM19基因在人惡性膠質(zhì)瘤CHG-5細(xì)胞的表

4、達(dá)對細(xì)胞表形的影響；并從細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞粘附、侵襲及凋亡等方面研究GRIM19基因是否具有誘導(dǎo)CHG-5細(xì)胞的分化作用，同時探索分析其作用機(jī)制，為將來膠質(zhì)瘤的治療奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.選擇AdEasy-1 System腺病毒載體系統(tǒng)，利用亞克隆的方法將GRIM19基因片段從pCDNA3.1（+）-GRIM19質(zhì)?？寺∪氪┧筚|(zhì)粒pAdTrack-CMV腺病毒載體。重組成功的pAdTrack-CMV-GRIM19載

5、體轉(zhuǎn)化已預(yù)先轉(zhuǎn)化的pAdEasy-1腺病毒骨架質(zhì)粒的BJ5183菌進(jìn)行同源重組，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd-GRIM19。 2.重組腺病毒質(zhì)粒pAd-GRIM19轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，小量包裝出重組腺病毒Ad-GRIM19，經(jīng)PCR初步鑒定后反復(fù)感染293T細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增，并采用氯化銫梯度離心法純化濃縮病毒。病毒滴度采用TCID50法測定，應(yīng)用EGFP報告基因及有限稀釋法檢測對CHG-5靶細(xì)胞的感染效率。Western Blo

6、t法檢測重組腺病毒Ad-GRIM19中的目的基因GRIM19的表達(dá)。同樣方式包裝與純化Ad-EGFP對照病毒。 3.CHG-5細(xì)胞分別經(jīng)Ad-GRIM19 and Ad-GFP感染的MOI值感染后分別在24h，48h以及72h觀察細(xì)胞表形的變化。臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力。CCK-8比色及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗檢測細(xì)胞體外增殖能力的變化。Transwell小室及細(xì)胞粘附實(shí)驗檢測細(xì)胞外基質(zhì)粘附及侵襲能力的改變.TUNEL實(shí)驗及Hoches

7、t33342染色法偵測GRIM19表達(dá)對凋亡影響。 4.免疫熒光染色檢測pSTAT3，GFAP及Vimentin蛋白在CHG-5細(xì)胞中的表達(dá)狀況。Real-Time PCR分別檢測Bcl-2，Bax，PCNA，C-myc，CCND1，GFAP or STAT3基因的mRNA變化。2-△△CT法分析各個基因的相對表達(dá)量。Western blot法進(jìn)一步分析各基因蛋白水平的變化。DHE熒光探針染色分析活性氧ROS的變化。細(xì)胞免疫組化

8、定性檢測CD133的表達(dá)。 結(jié)果: 1.酶切及測序鑒定表明重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-GRIM19亞克隆成功構(gòu)建。同源重組后的腺病毒質(zhì)粒pAd-GRIM19經(jīng)PacⅠ酶切后可見一條4.5kb和一條約30kb的條帶，表明同源重組成功。PacⅠ線性化重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行包裝，擴(kuò)增的病毒上清經(jīng)PCR鑒定表明擴(kuò)增條帶為GRIM19，證明包裝成功。所將大量擴(kuò)增的病毒經(jīng)過純化與濃縮后Ad-GFP與Ad-GRI

9、M19病毒的各自滴度可分別達(dá)1.12×1010pfu/mL；與9.6×109pfu/mL。純化的病毒能有效感染CHG-5靶細(xì)胞，Ad-GFP與Ad-GRIM19病毒對CHG-5細(xì)胞感染的MOI值分別為10與12。Western Blot結(jié)果重組腺病毒Ad-GRIM19能顯著提高GRIM19在CHG-5細(xì)胞中的表達(dá)。 2.Ad-GRIM19病毒感染導(dǎo)致CHG-5的細(xì)胞形態(tài)顯著改變。與Ad-GFP對照組比，Ad-GRIM19顯著抑制

10、CHG-5細(xì)胞的體外增殖，抑制克隆形成能力（P<0.01），并能顯著減弱CHG-5細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的粘附及侵襲能力（P<0.01）。Tunnel及Hochest33342熒光染色表明，Ad-GRIM19組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加。經(jīng)Real-Time PCR分析，Ad-GRIM19感染組中Bcl-2，PCNA，C-myc，CCND1及STAT3基因的mRNA水平明顯下調(diào)，而Bax與GFAP表達(dá)顯著上調(diào)。與Ad-GFP對照組相比，Ad-GRIM

11、19感染組活性氧產(chǎn)生大量釋放。 3.Western blot結(jié)果證實(shí)Bcl-2，PCNA，C-myc，CCND1及STAT3表達(dá)下調(diào)，Bax與GFAP表達(dá)顯著增加與Real-Time PCR結(jié)果一致。Ad-GRIM19能顯著下調(diào)STAT3磷酸化水平（p STAT3）。免疫組化結(jié)果顯示，CD133陽性細(xì)胞在Ad-GRIM19組CHG-5團(tuán)狀細(xì)胞表面聚集。 結(jié)論: 1.成功包裝并純化的GRIM19重組腺病毒能高效的感

12、染CHG-5細(xì)胞，顯著提高GRIM19在CHG-5細(xì)胞中的表達(dá)。 2.腺病毒介導(dǎo)的GRIM19在CHG-5細(xì)胞的表達(dá)能顯著改變CHG-5細(xì)胞形態(tài)，抑制其體外增殖與克隆形成；減弱對細(xì)胞外基質(zhì)的粘附及侵襲能力，增加ROS產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 3.腺病毒介導(dǎo)的GRIM19能明顯誘導(dǎo)CHG-5細(xì)胞分化，這種分化可能與STAT3的活性抑制導(dǎo)致Bcl-2，PCNA，C-myc，CCND1及STAT3表達(dá)下調(diào)以及Bax與GFAP表達(dá)增