腺病毒介導PTEN和TIMP-2抑制人腦膠質(zhì)瘤U87的實驗研究.pdf

1、研究目的:構(gòu)建攜帶PTEN和TIMP-2基因的Adeno-PTEN和Adeno-TIMP-2重組腺病毒載體,探討PTEN和TIMP-2對人腦膠質(zhì)瘤的惡性表型的影響,包括細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、侵襲和血管生成等方面,尤其是二者在侵襲和血管生成方面是否具有協(xié)同作用,同時探討PTEN與TIMP-2的抗膠質(zhì)瘤作用機制,為AdPTEN和AdTIMP-2重組腺病毒應用于人腦膠質(zhì)瘤細胞的基因治療提供實驗依據(jù).研究內(nèi)容:(1)采用分子生物學技術(shù),

2、將目的基因從質(zhì)粒載體上酶切下來,裝入穿梭質(zhì)粒pTRE-Shuttle,用PI-SceI、I-CeuI行雙酶切后,與Adeno-DNA骨架連接,構(gòu)建成重組腺病毒DNA.用PCR方法鑒定目的基因是否成功裝入.PacⅠ酶切線性化后,以Lipofectamine轉(zhuǎn)染293細胞,包裝出有感染力的復制缺陷型重組腺病毒,并在293細胞中進行擴增,采用空斑形成實驗確定病毒滴度;(2)用構(gòu)建的重組腺病毒感染人腦膠質(zhì)瘤U87,采用RT-PCR和Wester

3、n blot、ELISA方法從mRNA和蛋白水平檢測目的的基因的表達;用MTT試驗檢測PTEN與TIMP-2基因?qū)δ[瘤細胞增殖的作用;用流式細胞儀檢測目的基因?qū)δ[瘤細胞的細胞周期與細胞凋亡的影響;用明膠酶譜檢測轉(zhuǎn)染目的基因后人腦膠質(zhì)瘤U87細胞中MMP-2與MMP-9酶活性的變化;用Boyden侵襲小室檢測轉(zhuǎn)染目的基因后U87細胞體外侵襲力的變化;用MTT法檢測感染腺病毒的U87細胞上清對人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV-304的抑制作用;同時檢

4、測它對雞胚絨毛尿囊膜新生血管的作用;(3)PTEN與TIMP-2基因處理U87細胞后,植主裸鼠顱內(nèi)形成腦內(nèi)膠質(zhì)瘤動物模型,觀察攜帶目的基因的腺病毒對腫瘤生長的影響.并用免疫組化法檢測腫瘤組織中MMP-2、Ⅷ因子相關抗原、PTEN和TIMP-2的表達.研究結(jié)論:采用分子生物學技術(shù),成功構(gòu)建重組腺病毒載體AdPTEN和AdTIMP-2.體內(nèi)外實驗證實PTEN和TIMP-2基因?qū)θ四X膠質(zhì)瘤U87有明顯的抗腫瘤作用,表現(xiàn)在腫瘤增殖作用、細胞周期

5、調(diào)控、體外侵襲力和血管生成的抑制等方面;這可能通過下調(diào)MMP-2與MMP-9的表達與活性而實現(xiàn)的,在抗腫瘤增殖、調(diào)控細胞周期和腫瘤血管生成等方面二者無明顯抑同作用.PTEN和TIMP-2二者對體外侵襲力的抑制有協(xié)同作用,而MMP活性的改變與之不同步,這表明存在其它的信號通路參與PTEN對U87的侵襲力的調(diào)控作用.這表明AdPTEN、AdTIMP-2能抑制人腦膠質(zhì)瘤的多種惡性表型,通過進一步研究它們有可能成為治療膠質(zhì)瘤的一種有效方法,尤其