RXR激動(dòng)劑在高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥和氧化應(yīng)激中的作用和機(jī)制.pdf

1、糖尿病已成為越來(lái)越嚴(yán)重的全球性健康問(wèn)題。血糖升高是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的起始因素。血糖升高主要是通過(guò)炎癥和氧化應(yīng)激雙重機(jī)制對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生損傷。尋找和篩選能夠阻逆糖尿病環(huán)境下動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的藥物治療靶點(diǎn)，對(duì)糖尿病患者并發(fā)癥的防治具有重要意義。 RXR作為核激素受體超家族的成員，介導(dǎo)了許多種激素、維生素和藥物的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。RXR在核受體家族中具有獨(dú)特性，因?yàn)樗梢?/p>

2、和許多核受體形成異源二聚體，如過(guò)氧化物酶體增生物激活受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptor,PPAR)及肝臟X受體等，后兩種核受體在心血管功能的調(diào)控方面具有重要作用。9-cis-RA是被最早發(fā)現(xiàn)的RXR的天然配體，近來(lái)發(fā)現(xiàn)具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)和非甾體抗炎藥依托度酸(etodolac)[25]也能夠與RXR結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)了RX

3、R具有調(diào)控心血管功能的重要作用。另外，采用混合型高脂血癥的動(dòng)物模型進(jìn)行的研究結(jié)果顯示，RXR激動(dòng)劑能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。然而，RXR及其配體通過(guò)何種機(jī)制來(lái)調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化等心血管事件的進(jìn)程尚不清楚。 本課題通過(guò)模擬糖尿病患者的體內(nèi)環(huán)境建立高糖(33mM)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞模型，以炎癥和氧化應(yīng)激為切入點(diǎn)，深入探討高糖致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，探討RXR激動(dòng)劑在高糖致血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和氧化損傷過(guò)程中的作用及機(jī)制，闡明RXR在其

4、配體發(fā)揮效應(yīng)過(guò)程中的作用。為設(shè)計(jì)和篩選能夠預(yù)防糖尿病血管并發(fā)癥的藥物提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。 第一部分：RXR激動(dòng)劑在高糖誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程中的作用及機(jī)制 目的：動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病。在動(dòng)脈粥樣硬化早期，被激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)表達(dá)血管細(xì)胞粘附因子-1(vascularcelladhesionmolecular-1，VCAM-1)和細(xì)胞間粘附因子-1(intercellularadhesionmo

5、lecular-1，ICAM-1)促進(jìn)血循環(huán)中的單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。視黃醛X受體(retinoidXreceptor,RXR)通過(guò)與其它核受體形成異源二聚體介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)。本研究將探討RXR激動(dòng)劑在高糖致人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)炎癥反應(yīng)過(guò)程中的作用及機(jī)制。 方法：本研究中采用原代培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)HL-60細(xì)胞與HU

6、VEC間的粘附；ELISA和RT-PCR方法檢測(cè)ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)和分泌；Westernblot方法檢測(cè)p65亞基蛋白、IκB及其磷酸化蛋白水平；激光共聚焦顯微鏡結(jié)合免疫熒光標(biāo)記的方法觀察p65亞基在HUVEC內(nèi)的亞細(xì)胞分布；采用電泳遷移率變動(dòng)分析方法檢測(cè)NF-κB與DNA的結(jié)合活性。 結(jié)果：(1)高糖促進(jìn)HL-60細(xì)胞與HuVEC間的粘附，高糖增加HUVEC對(duì)ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，9-cis-RA和N

7、F-κB抑制劑PDTC能顯著抑制HL-60細(xì)胞與HUVEC間的粘附及高糖環(huán)境下粘附因子的表達(dá)；(2)9-cis-RA能夠顯著抑制高糖環(huán)境下p65亞基由胞漿向胞核的轉(zhuǎn)位及NF-κB與DNA的結(jié)合活性；(3)高糖促進(jìn)IκB蛋白的磷酸化和降解，而RXR激動(dòng)劑9-cis-RA能夠逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)IκB產(chǎn)生的效應(yīng)。 結(jié)論：RXR激動(dòng)劑9-cis-RA通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活下調(diào)高糖干預(yù)時(shí)ICAM-1和VCAM-1在人血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)。

8、 第二部分：RxR激動(dòng)劑在高糖誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用和機(jī)制 目的：RXR具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，但機(jī)制尚不清楚。本研究將對(duì)RXR的配體(9-cis-RA和SR11237)在高糖誘導(dǎo)HUVEC產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中的作用和機(jī)制進(jìn)行探討。 方法：從健康人臍靜脈分離HUVEC并進(jìn)行體外培養(yǎng)；用轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸的方法探討煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamideadeninedinucleoti

9、dephosphate，NADPH)氧化酶各亞基在氧化應(yīng)激中的作用，逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)合免疫雜交技術(shù)檢測(cè)各亞基的表達(dá)；用流式細(xì)胞學(xué)方法和共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧離子(reactiveoxygenspecies，ROS)的水平，評(píng)價(jià)HUVEC內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)度；Lucigenin化學(xué)發(fā)光法和GSTpull-down技術(shù)分別測(cè)定NADPH氧化酶的活性和Rac-1蛋白的激活；免疫雜交聯(lián)合共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)PKC的激活和表達(dá)；另

10、外，干擾RNA(siRNA)結(jié)合免疫熒光標(biāo)記技術(shù)研究RXRα僅的亞細(xì)胞分布及其在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)位。 結(jié)果：(1)NADPH氧化酶是高糖環(huán)境下HUVEC內(nèi)ROS的主要來(lái)源，Nox4、gp91phox和p22phox亞基是NADPH氧化酶的重要組成部分；(2)同蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)抑制劑的作用相似，RXR激動(dòng)劑9-cis-RA顯著抑制高糖誘導(dǎo)HUVEC產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)水平及Nox4、gp91phox和p2

11、2phox各亞基的表達(dá)；(3)9-cis-RA能夠抑制高糖誘導(dǎo)的Rac-1蛋白的激活及其由胞漿向胞膜的轉(zhuǎn)位；(4)PKC是Rac-1蛋白的上游激活物，9-cis-RA能夠抑制高糖環(huán)境下PKC的激活和表達(dá)；(5)正常生長(zhǎng)環(huán)境下，RXRα廣泛分布于HUVEC的胞漿和胞核，高糖促進(jìn)RXRα由胞漿向胞核穿梭，9-cis-RA能夠?qū)垢咛菍?duì)RXRα產(chǎn)生的效應(yīng)；(6)RXRαsiRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果證實(shí)了RXRα在9-cis-RA發(fā)揮抗氧化應(yīng)激效應(yīng)時(shí)起到

12、介導(dǎo)作用。 結(jié)論：RXR激動(dòng)劑通過(guò)鈍化PKC的活性來(lái)抑制高糖誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，胞漿中的RXRα可能介導(dǎo)了其配體的抗氧化應(yīng)激效應(yīng)。 本研究應(yīng)用33mM高糖干預(yù)模擬糖尿病患者體內(nèi)高糖環(huán)境，體外建立人血管內(nèi)皮細(xì)胞高糖損傷模型。發(fā)現(xiàn)NF-κB通路參與了高糖誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)過(guò)程，RXR激動(dòng)劑通過(guò)鈍化高糖環(huán)境下NF-κB通路的激活抑制高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。揭示了高糖誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生