登革病毒易感性相關(guān)的白紋伊蚊中腸特異性microRNA的鑒定、篩選與功能研究.pdf

1、登革熱、登革出血熱（Dengue hemorrhagic fever，DHF）是重要的蟲(chóng)媒傳染病之一，廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，埃及伊蚊和白紋伊蚊是其主要傳播媒介。由于尚無(wú)有效的疫苗和治療藥物，登革熱的防控仍然依賴(lài)于媒介蚊蟲(chóng)的防治。近二十年來(lái)，由于氣候變暖、城市化進(jìn)程加快以及國(guó)際間交流增加，其感染范圍不斷擴(kuò)大，并時(shí)有暴發(fā)，因此，有必要發(fā)展新的媒介控制方法。而通過(guò)基因調(diào)控改變蚊蟲(chóng)媒介效能，研究新型媒介控制措施成為諸多學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。媒介

2、效能的關(guān)鍵指標(biāo)是媒介蚊蟲(chóng)對(duì)病毒的易感性，蚊蟲(chóng)體內(nèi)存在多個(gè)阻止病原感染、擴(kuò)散和傳播的天然免疫防御屏障，其中，中腸是防止病原體入侵、建立體內(nèi)病毒感染的第一個(gè)靶器官，病原體能否感染中腸上皮細(xì)胞，是影響蚊蟲(chóng)對(duì)蟲(chóng)媒病毒易感性的重要因素。目前，對(duì)于中腸基因屏障的分子機(jī)制尚不明確，因此也成為媒介蚊蟲(chóng)對(duì)登革病毒易感性調(diào)控機(jī)制研究的瓶頸所在。闡明中腸與病原體相互作用的分子機(jī)制，將使通過(guò)基因操縱來(lái)調(diào)節(jié)媒介效能，進(jìn)而阻斷病原傳播成為可能，對(duì)制定新的媒介控制措

3、施具有重要的理論意義。
　　MicroRNA(miRNA)作為一類(lèi)新型的基因調(diào)控因子，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，在調(diào)控病毒感染和內(nèi)在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，蚊類(lèi)miRNA研究中，用RNA干擾(RNAi)的方法去除岡比亞按蚊Dcr1或Ago1（miRNA生成過(guò)程中必不可少的兩種酶）會(huì)導(dǎo)致中腸瘧原蟲(chóng)感染增加，而在埃及伊蚊中腸上皮細(xì)胞整合入穩(wěn)定表達(dá)具有RNAi作用的反向重復(fù)序列后，其中腸登革病毒復(fù)制得到明顯抑制，證明miRN

4、A在蚊類(lèi)中腸病原感染中發(fā)揮了重要作用，為研究蚊蟲(chóng)抗感染機(jī)制提供了新的思路。目前，在埃及伊蚊的研究表明登革病毒感染會(huì)引起埃及伊蚊身體及中腸組織miRNA的上調(diào)或下調(diào)，其中的一些miRNA在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)病毒復(fù)制的抑制或增強(qiáng)作用。但與白紋伊蚊中腸感染登革病毒相關(guān)的miRNA研究尚未見(jiàn)報(bào)道，而諸多研究證實(shí)，白紋伊蚊比埃及伊蚊中腸上皮細(xì)胞更容易感染登革病毒，但登革病毒從白紋伊蚊中腸擴(kuò)散到其它組織的能力低于埃及伊蚊，說(shuō)明兩者中腸屏障的機(jī)制

5、可能存在差異。雖有研究證實(shí)不同發(fā)育階段白紋伊蚊存在不同種類(lèi)miRNA，但miRNA的表達(dá)具有組織特異性，對(duì)于白紋伊蚊中腸內(nèi)特異表達(dá)的miRNA種類(lèi)及其與登革病毒感染的相關(guān)性研究尚無(wú)報(bào)道。
　　本研究針對(duì)白紋伊蚊中腸特異性miRNA及其在登革病毒感染過(guò)程中的變化規(guī)律進(jìn)行分析，并篩選部分miRNA進(jìn)行體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，試圖通過(guò)研究探討影響白紋伊蚊中腸細(xì)胞感染登革病毒的miRNA分子，為闡明中腸感染屏障機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為設(shè)計(jì)新的方法

6、來(lái)干擾或阻斷蚊蟲(chóng)傳播病原體的過(guò)程提供思路。
　　本研究以野外采集的廣州株白紋伊蚊為研究對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室條件下，用含有登革2型病毒(DENV-2)標(biāo)準(zhǔn)株(NGC)的人工血餐飼喂受試蚊蟲(chóng)，同時(shí)分別設(shè)立未吸血蚊和吸食不含病毒血餐蚊為空白對(duì)照和血餐對(duì)照，在飼喂后不同時(shí)間點(diǎn)獲取中腸組織，以傳統(tǒng)膠切割回收方法構(gòu)建小RNA庫(kù)并進(jìn)行高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析，獲得保守miRNA表達(dá)譜并預(yù)測(cè)新miRNA。進(jìn)一步通過(guò)研究中腸miRNA感染后變化特點(diǎn)，分

7、析感染與未感染中腸miRNA表達(dá)差異，尋找可能與登革病毒感染有關(guān)的miRNA分子。選擇差異表達(dá)miRNA，用人工合成的miRNA類(lèi)似物(mimic)和反義抑制物(inhibitor)轉(zhuǎn)染C6/36細(xì)胞，研究目的miRNA對(duì)C6/36細(xì)胞內(nèi)DENV-2復(fù)制的影響作用。
　　結(jié)果:
　　1.白紋伊蚊對(duì)DENV-2敏感性較高，中腸感染率高于身體其它部分感染率。
　　本實(shí)驗(yàn)中白紋伊蚊對(duì)DENV-2的感染率在5-7天迅速上升至6

8、3.3％，之后平穩(wěn)緩慢上升。中腸感染率高于身體其它部分感染率，兩組均數(shù)配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=3.872，P=0.018。
　　2.白紋伊蚊中腸miRNA表達(dá)種類(lèi)豐富，并具有組織特異性。
　　吸血和未吸血中腸樣本中，通過(guò)高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析共鑒定112種保守miRNA并預(yù)測(cè)了43種新miRNA，莖環(huán)引物qRT-PCR驗(yàn)證了之前在該蚊種未曾發(fā)現(xiàn)的aal-miR-1174、aal-miR-2951、aal

9、-miR-956-3p和aal-miR-956-5p的表達(dá)。
　　3.白紋伊蚊吸血后中腸miRNA變化具有多種模式。
　　吸血后1、2、5、7天，與未吸血蚊相比，miRNA變化特征被分為7大類(lèi)，分別是先降再升、降-升-降、速升速降、慢升略降、持續(xù)升高、持續(xù)降低、基本不變，其中，先降再升、降-升-降是主要模式，構(gòu)成比分別為20％和32％，幾個(gè)高水平表達(dá)的miRNA，如aal-miR-184、aal-miR-956-3p、aal

10、-let-7、aal-miR-281和aal-miR-34均屬于此類(lèi)。變化不顯著的類(lèi)型中，多數(shù)miRNA表達(dá)水平非常低。吸食含DENV-2血餐后中腸miRNA變化模式種類(lèi)未變，但有些miRNA所屬類(lèi)型發(fā)生改變，如aal-miR-276-3p和aal-miR-275-3p由“先降再升”改變?yōu)椤跋壬俳怠薄?br>　　4.感染與未感染蚊中腸miRNA表達(dá)差異顯著，上調(diào)種類(lèi)多于下調(diào)種類(lèi)。
　　通過(guò)相同時(shí)間點(diǎn)配對(duì)比較感染與未感染蚊中腸mi

11、RNA表達(dá)差異，共篩選到74個(gè)差異表達(dá)顯著的miRNA。按fold-change＞2、歸一化表達(dá)量至少在一組中不低于30的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步篩選出22個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中16個(gè)呈上調(diào)表達(dá)，包括aal-miR-1767、aal-miR-276-3p、aal-miR-193-5p、aal-miR-1951、aal-miR-4728-5p、aal-miR-6134、aal-miR-622、aal-miR-1420b-5p、aal-miR-99

12、8-5p等，4個(gè)呈下調(diào)表達(dá)，包括aal-miR-1273f、aal-miR-4448、 aal-miR-6666-3p和aal-miR-15-3p。而aal-miR-989和aal-miR-2941在不同的對(duì)比方式中分別表現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)。
　　5.差異表達(dá)miRNA在埃及伊蚊預(yù)測(cè)的靶基因數(shù)量多，具有多種功能，43種miRNA也在DENV-2預(yù)測(cè)到靶基因。
　　用RNAhybrid軟件預(yù)測(cè)差異表達(dá)的miRNA在埃及伊蚊基因

13、組的靶基因，根據(jù)自由能高低篩選出靶基因數(shù)量為3608，結(jié)合位點(diǎn)有63386個(gè)，GO富集及代謝通路分析表明這些靶基因與多種生理功能有關(guān)。共有43種差異表達(dá)miRNA在DENV-2基因組預(yù)測(cè)到靶基因，分別位于DENV-2基因組非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2A、NS3、NS4A、NS5和E蛋白等。
　　6.C6/36細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明4個(gè)miRNA對(duì)細(xì)胞內(nèi)DENV-2復(fù)制有影響作用。
　　對(duì)5個(gè)隨機(jī)選取的miRNA人工合成mimic和in

14、hibtor，體外C6/36細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明， aal-miR-1767、aal-miR-4728-5p和aal-miR-276-3p能夠增強(qiáng)C6/36細(xì)胞內(nèi)DENV-2復(fù)制，aal-miR-4448能夠抑制C6/36細(xì)胞內(nèi)DENV-2復(fù)制。
　　結(jié)論:
　　1.首次對(duì)白紋伊蚊中腸特異表達(dá)的miRNA進(jìn)行了鑒定分析，發(fā)現(xiàn)了新的在白紋伊蚊體內(nèi)表達(dá)的保守miRNA，預(yù)測(cè)了新miRNA，豐富了蚊蟲(chóng)miRNA的種類(lèi)。
　　2.

15、白紋伊蚊吸血后，中腸miRNA的變化復(fù)雜多樣，但具有一定的規(guī)律性，隨時(shí)間變化主要表現(xiàn)為7大類(lèi)型，分別是先降再升、降-升-降、速升速降、慢升略降、持續(xù)升高、持續(xù)降低、基本不變。其中，先降再升、降-升-降是主要模式，分別占構(gòu)成比的20％和32％。吸食含DENV-2血餐后，miRNA變化模式的類(lèi)型未發(fā)生變，但有少數(shù)miRNA所屬模式發(fā)生了改變。表達(dá)模式發(fā)生改變的miRNA可能在中腸感染DENV-2過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。
　　3.感染與未感

16、染蚊配對(duì)差異分析結(jié)果表明，經(jīng)口感染DENV-2后中腸miRNA變化顯著，且不同時(shí)期表現(xiàn)不同。感染后24小時(shí)，多數(shù)miRNA表達(dá)上調(diào)，感染后48小時(shí)，多數(shù)miRNA表達(dá)下調(diào);攝入DENV-2后第7天，感染與未感染蚊中腸差異表達(dá)miRNA的種類(lèi)最多，變化幅度最大。不同時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)的miRNA種類(lèi)變化較大，表明白紋伊蚊中腸miRNA調(diào)控DENV-2感染的作用機(jī)制非常復(fù)雜，miRNA的變化呈現(xiàn)出瞬時(shí)性、復(fù)雜性和多變性的特點(diǎn)。
　　4.體