黃稈烏哺雞竹稈色變異基因(PvLhca1和PvLhca2)的克隆、鑒定及功能分析.pdf

1、黃稈烏哺雞竹（Phyllostachys vivax f.aureocaulis）是竹亞科（Bambusoideae Nees）烏哺雞竹(Phyllostachys vivax McClure)的變型，竹稈為黃色，節(jié)間會(huì)出現(xiàn)不同寬度和深淺的綠色條紋，也有全綠稈和全黃稈的表型。本課題組利用抑制差減雜交技術(shù)構(gòu)建了全黃稈和全綠稈筍差異表達(dá)基因的SSH文庫，鑒定了光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)中PvLhca1和PvLhca2基因，實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析表

2、明，兩個(gè)基因在黃稈烏哺雞竹稈色變異過程中表達(dá)量變化顯著。
　　為了探究PvLhca1和PvLhca2基因與黃稈烏哺雞竹稈色變異之間的關(guān)系，本課題首先克隆了黃稈烏哺雞竹PvLhca1和PvLhca2基因cDNA全長序列，通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同發(fā)育階段和不同呈色程度下PvLhca1和PvLhca2基因的表達(dá)模式，通過構(gòu)建植物過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥探究其基因功能。主要獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.以全綠稈為材料，通過

3、RACE技術(shù)克隆了PvLhca1和PvLhca2的cDNA全長，PvLhca1和PvLhca2的cDNA全長分別為741bp和為789bp，分別編碼246和262個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。它們有三個(gè)典型的α跨膜螺旋。進(jìn)化樹分析表明它們與毛竹（Phyllostachys edulis）中的相應(yīng)蛋白親緣關(guān)系最近。
　　2.分別采集黃稈烏哺雞竹全綠與全黃竹筍的四個(gè)節(jié)間組織:白色、淺綠（淺黃）、淡綠（淡黃）和全綠節(jié)間（全黃節(jié)間），以及條紋竹筍

4、的三個(gè)節(jié)間不同條紋區(qū)（淺綠、淺黃、淡綠、淡黃、深綠和深黃條紋）。分別刮取節(jié)間外表皮，提取RNA，通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比于綠稈竹筍，在全黃稈竹筍逐漸著色階段，PvLhca1和PvLhca2基因表達(dá)量相對(duì)較低，有可能影響葉綠素的積累，調(diào)控稈色變化。
　　3.蛋白質(zhì)是基因功能的體現(xiàn)者，制備PvLhca1和PvLhca2抗體，利用WB（Western Blot）技術(shù)檢測(cè)PvLhca1和PvLhca2在黃色和綠色條紋中的蛋白

5、表達(dá)量。結(jié)果表明，PvLhca1蛋白產(chǎn)物在淺綠條紋中的表達(dá)量明顯高于淺黃條紋，與定量RT-PCR結(jié)果一致。PvLhca2蛋白產(chǎn)物分子大小高于預(yù)測(cè)的分子量，推測(cè)PvLhca2蛋白產(chǎn)物易與PvLhca3蛋白產(chǎn)物形成二聚體。
　　4.構(gòu)建植物過表達(dá)載體pC1301-PvLhca1和pC1301-PvL hca，轉(zhuǎn)化擬南芥，PCR和RT-PCR檢測(cè)表明PvLhca1和PvLhca2整合入擬南芥基因組并轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因植株的葉片平均數(shù)分別為28

6、和25片，明顯多于野生型擬南芥平均數(shù)15片;轉(zhuǎn)基因植株光系統(tǒng)Ⅰ電子傳遞效率(ETR，electron transport rate)比野生型擬南芥植株明顯降低。這些結(jié)果說明，過量表達(dá)的PvLhca1與PvLhca2降低了光系統(tǒng)Ⅰ電子傳遞效率，可能引起植株的吸收光譜發(fā)生變化。
　　5.分別克隆了全綠稈與全黃稈PvLhca1和PvLhca2基因的cDNA序列和DNA序列，序列比對(duì)表明來源于不同稈色的PvLhca1和PvLhca2基因的

7、cDNA序列無差異。全黃稈中PvLhca1和PvLhca2基因DNA序列均與全綠稈內(nèi)的基因序列有差異。具體表現(xiàn)為全黃稈中PvLhca1為全綠稈中PvLhca1序列中第二內(nèi)含子一段序列移動(dòng)至其第三內(nèi)含子。全黃稈中PvLhca2基因DNA序列相比于全綠稈中PvLhca2基因缺失了所有的內(nèi)含子。內(nèi)含子位置的改變與缺失可能影響了全黃稈中PvLhca1和PvLhca2的表達(dá)模式的變化。
　　6.通過基因組步移法，分別克隆PvLhca1和Pv

8、Lhca2上游調(diào)控序列，獲得全綠稈中PvLhca1上游調(diào)控序列139bp，全黃稈中PvLhca1上游調(diào)控序列1121bp;獲得全綠稈中PvLhca2基因上游調(diào)控序列286bp，全黃稈中PvLhca2基因上游調(diào)控序列372bp?，F(xiàn)有序列比對(duì)得出PvLhca1和PvLhca2基因上游的調(diào)控序列黃稈和綠稈中并無差異。通過PlantCARE檢測(cè)到PvLhca1和PvLhca2上游調(diào)控序列中均有溫度相關(guān)響應(yīng)元件與光響應(yīng)元件。
　　總之，本課

9、題克隆了PvLhca1和PvLhca2基因全長序列，轉(zhuǎn)基因結(jié)果表明PvLhca1和PvLhca2基因的過表達(dá)可能導(dǎo)致光合電子傳遞效率的降低。相比全綠稈，在全黃稈逐漸著色時(shí)期PvLhca1和PvLhca2基因相對(duì)表達(dá)量低于全綠稈，WB檢測(cè)同樣證明兩個(gè)基因蛋白產(chǎn)量相對(duì)較低，這些表達(dá)量的變化可能導(dǎo)致了LHCⅠ不能完美組裝，從而影響了全黃稈葉綠素的沉積和稈色的變化。比較了全綠稈和全黃稈間PvLhca1和PvLhca2 DNA序列的不同，發(fā)現(xiàn)基因