Nrf2在液壓沖擊腦損傷抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用以及姜黃素對其的影響.pdf

1、第一部分Nrf2在液壓沖擊腦損傷抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用
　　 目的:觀察大鼠液壓沖擊腦損傷后Nrf2的表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡及其相關(guān)調(diào)控因子的變化，探討Nrf2在液壓沖擊腦損傷抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用。
　　 方法:成年、雄性SD大鼠56只，體重300g±50g，隨機(jī)分為2個(gè)組:對照組(NC組)8只，常規(guī)麻醉頭顱開骨窗，不行液壓沖擊;腦損傷組(TBI組)48只，按傷后1h，6h，12h，24h，3d，7d六個(gè)時(shí)間點(diǎn)再隨機(jī)分為6

2、個(gè)亞組，每組8只，常規(guī)麻醉頭顱開骨窗，制作液壓沖擊腦損傷動(dòng)物模型。
　　 NC組在開骨窗后24h進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分后，TBI組于術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后，兩組動(dòng)物均過度麻醉處死，開顱取腦，從損傷區(qū)前緣取大約100mg腦組織應(yīng)用干濕重法測腦組織含水量;經(jīng)損傷區(qū)切成約3mm厚冠狀腦組織片，多聚甲醛固定，HE染色行組織學(xué)觀察，免疫組織化學(xué)染色方法檢測Nrf2、caspase-3和caspase-12，原位末端標(biāo)記法（TUNEL）

3、檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化;損傷區(qū)域后緣腦組織矢狀分為兩份，其中一份用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測Nrf2mRNA的表達(dá)，另外一份用免疫蛋白印跡(WesternBlot)檢測Nrf2核蛋白、Nrf2胞漿蛋白、caspase-3蛋白和caspase-12蛋白含量。
　　 結(jié)果:
　　 1、神經(jīng)功能評(píng)分
　　 與NC組相比較，TBI組在傷后6h神經(jīng)功能評(píng)分較低(2.75±0.707，P＜0.05);12h（4.

4、50±0.756）稍有所升高，但仍低于NC組(P＜0.05);24h(2.25±0.707，P＜0.05)評(píng)分又開始下降;3d(5.75±0.916，P＜0.05)評(píng)分逐漸升高，到7d（7.750±0.707，P＜0.05）仍低于NC組。
　　 2、組織學(xué)觀察
　　 TBI組動(dòng)物挫傷灶灶周腦組織6h開始出現(xiàn)細(xì)胞水腫，于12h時(shí)較前有所加重，24h見細(xì)胞體積比12h明顯增大，水腫程度最明顯，胞漿淡染，部分出現(xiàn)空泡樣變性，伴

5、隨有膠質(zhì)細(xì)胞增生，3d細(xì)胞水腫的程度稍減輕，7d膠質(zhì)細(xì)胞逐漸顯著增生細(xì)胞水腫明顯減退。
　　 3、大鼠腦組織含水量測定
　　 與NC組相比，TBI組腦組織含水量1h時(shí)無差異(P＞0.05），6h稍升高（78.937±0.125，P＜0.05），12h時(shí)明顯升高(81.801±0.601，P＜0.05)，24h時(shí)達(dá)到高峰(83.234±0.321，P＜0.05)，3d時(shí)開始下降（82.143±0.304，P＜0.05），7

6、天明顯下降（81.290±0.305，P＜0.05），仍高于NC組。
　　 4、免疫組化檢測Nrf2、Caspase-3和Caspase-12
　　 Nrf2表達(dá):NC組腦組織Nrf2有少量表達(dá)，主要位于膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元胞漿中。與NC組比較，TBI組動(dòng)物損傷側(cè)的腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞核中Nrf2表達(dá)明顯升高，傷后1h（0.307±0.023，P＜0.05）表達(dá)開始增高，24h（1.288±0.015，P＜0.05）達(dá)到高峰，隨后

7、逐漸降低。
　　 Caspase-3表達(dá):與NC組比較，TBI組挫傷灶周腦組織中Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)于6h（0.560±0.014，P＜0.05）開始增多，12h（0.795±0.019，P＜0.05）陽性細(xì)胞不但數(shù)量增加，而且著色也加深，24h（2.047±0.022，P＜0.05）陽性細(xì)胞數(shù)量及著色程度達(dá)到最高峰，并維持至3d(1.757±0.023，P＜0.05)，7d（0.920±0.031，P＜0.05）陽性細(xì)

8、胞數(shù)目及著色程度下降，但仍高于NC組。
　　 Caspase-12表達(dá):TBI組動(dòng)物挫傷灶灶周腦組織中Caspase-12陽性細(xì)胞數(shù)于6h開始增多（0.585±0.021，P＜0.05），12h較前增加（0.878±0.019，P＜0.05），而且著色程度逐漸增加，至24h陽性細(xì)胞數(shù)和著色深度達(dá)到最高峰（1.989±0.015，P＜0.05），以后逐漸降低。
　　 5、WesternBlot測定胞漿、胞核Nrf2蛋白，c

9、aspase-3、caspase-12蛋白
　　 與NC組相比，TBI組動(dòng)物挫傷灶灶周腦組織中Nrf2核蛋白表達(dá)從1h開始增高(0.563±0.026，P＜0.05)，6h繼續(xù)增高(0.814±0.039，P＜0.05)，12h(1.043±0.039，P＜0.05)持續(xù)增高，24h達(dá)到高峰(1.408±0.031，P＜0.05)，3d時(shí)降低(1.111±0.045，P＜0.05)，7d后明顯降低(0.803±0.027)，但仍

10、高于NC組(P＜0.05)。
　　 與NC組相比，TBI組Nrf2胞漿蛋白表達(dá)各時(shí)間點(diǎn)無明顯差異(P＞0.05）。
　　 與NC組相比，TBI組caspase-3蛋白表達(dá)于6h開始增高（0.801±0.029，P＜0.05)，12h（1.142±0.029，P＜0.05）繼續(xù)增高，24h達(dá)到高峰(1.413±0.042，P＜0.05)，3d時(shí)降低(1.151±0.100，P＜0.05)，7d后明顯降低(0.834±0.0

11、22)，但仍高于NC組(P＜0.05)。
　　 與NC組相比，TBI組caspase-12蛋白表達(dá)于6h開始逐漸增高(0.756±0.124，P＜0.05)，12h(1.098±0.051，P＜0.05)繼續(xù)增高，24h達(dá)到高峰(1.382±0.110，P＜0.05)，3d時(shí)開始降低(0.814±0.041，P＜0.05)，7d后明顯降低(0.567±0.017)，但仍高于正常（P＜0.05）。
　　 6、RT-PCR測

12、定Nrf2mRNA表達(dá)
　　 NC組中，Nrf2mRNA有少量的表達(dá)。TBI組各時(shí)間點(diǎn)相比，Nrf2mRNA水平在損傷后各時(shí)間點(diǎn)無明顯變化，且與NC組相比也無明顯差異（P＞0.05）。
　　 7、TUNEL檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡
　　 兩組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均可見TUNEL陽性細(xì)胞，其中，NC組僅見少量的陽性細(xì)胞。TBI組6h（27.385±0.158，P＜0.05）凋亡細(xì)胞開始增多，12h（42.366±0.303，P＜0

13、.05）較前明顯提高，24h（55.222±0.124，P＜0.05）達(dá)高峰，3d（48.207±0.149，P＜0.05）開始降低，7d（22.226±0.273，P＜0.05）繼續(xù)降低仍高于NC組。
　　 8、Nrf2、神經(jīng)細(xì)胞凋亡與caspase-3蛋白和caspase-12蛋白表達(dá)相關(guān)性分析TBI組caspase-3和caspase-12表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)(rcaspase-3=0.871，P＜0.01，rcas

14、pase-12=0.916，P＜0.01)。caspase-3和caspase-12表達(dá)也與Nrf2核蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(rcaspase-3=0.918，P＜0.01和rcaspase-12=0.961,P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、液壓沖擊腦損傷后Nrf2蛋白、神經(jīng)細(xì)胞凋亡，caspase-3及caspase-12蛋白均呈高表達(dá)。
　　 2、TBI后Nrf2被激活，可能通過抑制caspase-3及c

15、aspase-12表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 第二部分:姜黃素對液壓沖擊腦損傷Nrf2抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡影響
　　 目的:觀察不同劑量姜黃素對液壓沖擊腦損傷Nrf2及其神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，并探討其機(jī)制。
　　 方法:健康成年雄性SD大鼠144只，體重300g±50g，隨機(jī)分為3組:腦損傷組（TBI組）、姜黃素低劑量組（LC組）和姜黃素高劑量組(HC組)組。每組再根據(jù)腦損傷后1h，6h，12h，24

16、h，3d，7d六個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為6個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只大鼠。LC組和HC組分別于制作模型術(shù)后，往大鼠腹腔注射姜黃素，濃度分別為50mg/kg和100mg/kg。
　　 TBI組、LC組和HC組大鼠常規(guī)進(jìn)行液壓沖擊腦組織損傷模型，各亞組按對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，再用10％水合氯醛注射過度麻醉，斷頭處死，開顱取腦，從損傷區(qū)的前緣取100mg左右腦組織應(yīng)用干濕重法測腦組織含水量，經(jīng)損傷區(qū)域切成3mm左右冠狀腦片，HE染色，免疫組化檢

17、測Nrf2、caspase-3和caspase-12，原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化;損傷區(qū)域后緣按矢狀方向分為兩部分，一部分用免疫蛋白印跡(WestemBlot)檢測Nrf2核蛋白、Nrf2胞漿蛋白、caspase-3蛋白和caspase-12蛋白含量。另外一部分用于RT-PCR檢測Nrf2mRNA變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、神經(jīng)功能評(píng)分
　　 與TBI組相比，LC組和HC組神經(jīng)功能評(píng)分各

18、時(shí)間點(diǎn)均有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。LC組和HC組組間比較，僅于12h(4.750±0.886,4.875±0.835)、24h(2.500-0.926,2.875±0.991)、3d（6.125±1.126，6.375±1.685）差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2、組織學(xué)觀察
　　 LC組和HC組各個(gè)對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與腦損傷組相比較，腦組織水腫的范圍變小，程度有所減輕，膠質(zhì)細(xì)胞的增生變?nèi)?，炎性?xì)胞

19、滲出變少，神經(jīng)元的周圍間隙也縮小。HC組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞水腫程度均輕于LC組。
　　 3、大鼠腦組織含水量測定
　　 與TBI組比較，LC組和HC組1h無差別(78.204±0.318，78.154±0.244，78.105±0.263，P＞0.05)，6h明顯低于腦損傷組(78.937±0.125，78.553±0.179，78.121±0.327)，差異具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05），LC組和HC組之間無差別，（P＞0

20、.05），12h三組之間兩兩比較均有差異(P＜0.05)，腦水含量分別為（81.801±0.601，80.763±0.159，79.449±0.798），24h時(shí)腦水含量均達(dá)最高，且三組之間比較均有差異(P＜0.05），腦水含量分別為(83.234±0.321，82.218±0.257，80.945±0.084)，3d開始下降，三組之間比較同樣有差異(82.143±0.304，81.178±0.181，79.939±0.025，P＜0.

21、05)，7d時(shí)明顯降低(81.290±0.305，80.344±0.158，79.702±0.194)，LC組、HC組仍稍高于TBI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），但LC組與HC組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 4、免疫組織化學(xué)檢測Nrf2、Caspase-3和Caspase-12
　　 與TBI組相比，LC組和HC組Nrf2蛋白表達(dá)各時(shí)間點(diǎn)均高于TBI組，以12h(0.742±0.074,1.

22、198±0.151,0.581±0.061)、24h(1.532±0.052,1.278±0.051，2.058±0.045)、3d（1.301±0.025，1.102±0.071，1.980±0.214）最為明顯（P＜0.05）。LC組和HC組各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HC組明顯高于LC組。
　　 Caspase-3蛋白表達(dá)，與TBI組相比，LC組和HC組除1h(0.353±0.026，0.350±0.0

23、28，0.347±0.021，P＞0.05)外其他各時(shí)間點(diǎn)均低于TBI組，以12h（0.565±0.025，0.423±0.025，0.802±0.029）、24h（1.597±0.165，1.202±0.306，1.997±0.051）、3d（1.285±0.023，1.040±0.031，1.801±0.034）最為明顯（P＜0.05）。HC組明顯低于LC組。
　　 Caspase-12蛋白表達(dá)，與TBI組相比，LC組和HC

24、組除1h(0.451±0.033，0.432±0.106，0.443±0.102，P＞0.05)外其他各時(shí)間點(diǎn)均低于TBI組，以12h（0.881±0.026，0.671±0.034，0.585±0.106）、24h（1.990±0.045，1.548±0.036，1.058±0.027）、3d（1.779±0.037，1.333±0.026，0.938±0.027）最為明顯（P＜0.05）。HC組明顯低于LC組。
　　 5、W

25、esternBlot測定胞漿、胞核Nrf2蛋白，caspase-3、caspase-12蛋白
　　 TBI組、LC組和HC組之間各時(shí)間點(diǎn)Nrf2核蛋白表達(dá)比較均有明顯差異，以12h（1.056±0.027，1.173±0.018，1.287±0.018）、24h（1.415±0.041，1.619±0.029，1.840±0.028）、3d（1.087±0.038，1.257±0.196，1.427±0.021）最為明顯（P＜0

26、.05）。且HC組高于LC組和TBI組，LC組也高于TBI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 三組之間各時(shí)間點(diǎn)胞漿Nrf2蛋白表達(dá)比較無明顯差異，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　 Caspase-3蛋白表達(dá)，TBI組、LC組和HC組三組相比1h(0.557±0.031，0.555±0.024，0.547±0.102)無明顯差異(P＞0.05），6h（1.242±0.039，1.139±0.103，1.

27、033±0.005）開始有差別，以12h(1.662±0.121，1.385±0.028，1.237±0.018),24h(2.113±0.041,1.625±0.029,1.269±0.028)、3d(2.017±0.038，1.625±0.196，1.251±0.021)最為明顯(P＜0.05)。且HC組高于LC組和TBI組，LC組也高于TBI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 Caspase-12蛋白表達(dá)，TB

28、I組、LC組和HC組三組相比1h(0.563±0.027，0.536±0.120，0.543±0.024)無明顯差異(P＞0.05），6h(1.024±0.101，0.823±0.054，0.648±0.051)開始有差別，以12h(1.180±0.042，1.037±0.161，0.931±0.005)，24h(1.359±0.045，1.225±0.024，1.147±0.057)，3d(1.276±0.101，1.015±0.10

29、1，0.937±0.103)最為明顯(P＜0.05)。且HC組高于LC組和TBI組，LC組也高于TBI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 6、RT-PCR測定Nrf2mRNA
　　 TBI組、LC組和HC組各時(shí)間點(diǎn)相比Nrf2mRNA表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。
　　 7、TUNEL檢測
　　 細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，TBI組相比，LC組和HC組除1h(11.611±0.075，11.571±0

30、.345，11.308±0.155，P＞0.05)外其他各時(shí)間點(diǎn)均低于TBI組，以12h(42.310±0.024,39.658±0.241,36.376±1.024),24h(54.149±0.126,52.391±0.241，47.945±0.255)，3d(48.307±0.260，45.319±0.132，42.486±0.321)最為明顯（P＜0.05）。HC組明顯低于LC組。
　　 結(jié)論:
　　 1、大鼠液壓