線粒體損傷在NAFLD進(jìn)展中的作用機(jī)制以及姜黃素對其的影響.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）與心血管疾病關(guān)系密切，但是兩者相互聯(lián)系的分子機(jī)制還不甚清楚，原因之一就是缺乏合適的動(dòng)物模型。我們擬通過高脂飲食誘導(dǎo)新西蘭兔，觀察高脂飲食下機(jī)體重要器官疾病的發(fā)展過程，建立NAFLD和動(dòng)脈粥樣硬化的復(fù)合模型，為研究聯(lián)系兩者之間的分子機(jī)制建立實(shí)驗(yàn)平臺。 線粒體損傷被認(rèn)為是NAFLD從單純性脂肪肝向肝炎進(jìn)展的關(guān)鍵分子機(jī)制，但是NAFLD引

2、起線粒體損傷的機(jī)制尚不明確。脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）能誘導(dǎo)線粒體通透轉(zhuǎn)換孔（mitochondria permeability transition pore，MPT）的瞬間開放，導(dǎo)致線粒體勢能瞬間崩潰，引起電子泄漏，導(dǎo)致過多活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成。ROS通過氧化損傷線粒體蛋白和DNA而引起線粒體功能障礙，損傷的線粒體又繼發(fā)ROS生成增多，形成ROS和線粒體損傷

3、的惡性循環(huán)。同時(shí)過多的ROS耗竭機(jī)體抗氧化系統(tǒng)，引起機(jī)體對繼發(fā)的‘二次’打擊因素敏感性升高。因此我們設(shè)想NAFLD時(shí)，F(xiàn)FA引起的ROS和線粒體損傷的惡性循環(huán)是NAFLD進(jìn)展的分子機(jī)制。姜黃素通過裂解ROS以及上調(diào)抗氧化酶而發(fā)揮抗氧化和保護(hù)線粒體的作用，成為治療NAFLD有前景的藥物。 目的： ⑴建立非酒精性脂肪性肝病與動(dòng)脈粥樣硬化的復(fù)合模型，觀察NAFLD對心血管的影響。 ⑵探討活性氧自由基（ROS）介導(dǎo)的線粒

4、體損傷在NAFLD進(jìn)展中的作用以及姜黃素對NAFLD的保護(hù)作用。 方法和結(jié)果： ⑴用高脂飲食誘導(dǎo)新西蘭家兔2、4、6、8、10、12周，收集肝臟、升主動(dòng)脈、胰腺、心肌標(biāo)本行病理檢查。發(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導(dǎo)下NAFLD的發(fā)生早于動(dòng)脈粥樣硬化，胰腺和心肌在光鏡下未見病理改變。 ⑵我們通過CD（choline deficiency diet，CD）飲食誘導(dǎo)建立NAFLD不同階段疾病模型，檢測肝臟勻漿的TBARS（Thioba

5、rbituric Acid Reactive Substances，TBARS)、還原性谷胱甘肽（reduced glutathione hormone，GSH）、超氧物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)活力。發(fā)現(xiàn)隨著CD飲食誘導(dǎo)時(shí)間的延長肝臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物TBARS逐漸升高，而肝臟的非酶抗氧化物GSH卻逐漸衰竭，抗氧化酶活力逐漸下降

6、。說明肝臟脂肪沉積能引起活性自由基累積和氧化損傷。 ⑶用不同比例的軟脂酸和油酸混合液誘導(dǎo)HL-7702(L02)細(xì)胞，通過檢測細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡比例，研究不同的脂肪酸對細(xì)胞的影響。發(fā)現(xiàn)①當(dāng)兩者以2：1比例混合誘導(dǎo)L02細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的TG沉積較對照組顯著增加，對細(xì)胞的損傷作用最低，成功建立了NAFLD‘一次’打擊模型。②軟脂酸和油酸對L02細(xì)胞有不同的損傷作用，軟脂酸主要是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死，引起細(xì)胞內(nèi)TG沉積的作用微弱。油酸誘導(dǎo)

7、L02細(xì)胞TG（triglyceride，TG）沉積的作用較為明顯，而對細(xì)胞的致凋亡和壞死的作用微弱。③FFA的細(xì)胞毒力有誘導(dǎo)時(shí)間、脂肪酸飽和度、濃度依賴性。 ⑷給予1.0mM/L的OP21液（油酸：軟脂酸＝2：1）誘導(dǎo)L02細(xì)胞24、48小時(shí)之后，再給予不同濃度的雙氧水刺激5小時(shí)，檢測細(xì)胞凋亡和壞死的發(fā)生比例。利用外源性ROS刺激脂肪變L02細(xì)胞成功建立了NAFLD‘二次打擊’模型。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞脂肪變性越嚴(yán)重，對外源性ROS打擊越

8、敏感。 ⑸用1mM/L的雙氧水孵育24、48小時(shí)脂肪變的L02細(xì)胞5小時(shí)，檢測細(xì)胞凋亡、capase-3活力、ROS水平以及線粒體勢能。發(fā)現(xiàn)脂肪酸和雙氧水均能引起L02細(xì)胞線粒體勢能崩潰、ROS生成上調(diào)；脂肪變L02細(xì)胞對外源性ROS的敏感性升高，并與病變嚴(yán)重程度正相關(guān)。 ⑹用OP21液（油酸：軟脂酸＝2：1）誘導(dǎo)L02細(xì)胞24、48、72小時(shí)，檢測細(xì)胞MDA（malondialdehyde，丙二醛）、GSH、SOD活力

9、、CAT活力。發(fā)現(xiàn)隨著FFA誘導(dǎo)時(shí)間的延長，細(xì)胞GSH逐漸耗竭，SOD活力，CAT活力逐漸下降；脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（MDA）逐漸升高；線粒體勢能逐漸降低、ROS逐漸升高。說明FFA引起細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)失衡，細(xì)胞存在氧化應(yīng)激。 ⑺用5、12.5、25uM/L的姜黃素干預(yù)脂肪變細(xì)胞24、48小時(shí)，給予雙氧水刺激5小時(shí)，檢測細(xì)胞凋亡和caspase-3活力。發(fā)現(xiàn)高濃度的姜黃素能誘導(dǎo)L02細(xì)胞發(fā)生凋亡，ROS能加重L02細(xì)胞對姜黃素誘導(dǎo)凋亡